Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen
Summary
Diese Arbeit berichtet über eine Methode zur Kontrolle des Herzrhythmus intakter muriner Herzen von transgenen Kanalrhodopsin-2 (ChR2) Mäusen unter Verwendung lokaler Photostimulation mit einem Mikro-LED-Array und gleichzeitiger optischer Kartierung des Epikardialmembranpotentials.
Abstract
Ventrikuläre Tachyarrhythmien sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Die elektrische Defibrillation mit hochenergetischen Elektroschocks ist derzeit die einzige Behandlung für lebensbedrohliches Kammerflimmern. Defibrillation kann jedoch Nebenwirkungen haben, einschließlich unerträglicher Schmerzen, Gewebeschäden und einer Verschlechterung der Prognose, was auf einen erheblichen medizinischen Bedarf für die Entwicklung sanfterer Herzrhythmusmanagementstrategien hinweist. Neben energiereduzierenden elektrischen Ansätzen wurde die kardiale Optogenetik als leistungsfähiges Werkzeug zur Beeinflussung der Herzaktivität durch lichtempfindliche Membranionenkanäle und Lichtpulse eingeführt. In der vorliegenden Studie wird eine robuste und valide Methode zur erfolgreichen Photostimulation von Langendorff-perfundierten intakten Mausherzen beschrieben, die auf Multi-Site-Pacing unter Verwendung eines 3 x 3-Arrays von Mikro-Leuchtdioden (Mikro-LED) basiert. Die simultane optische Kartierung von Epikardialmembranspannungswellen ermöglicht die Untersuchung der Effekte der regionsspezifischen Stimulation und wertet die neu induzierte Herzaktivität direkt vor Ort aus. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Wirksamkeit der Defibrillation stark von den Parametern abhängt, die für die Photostimulation während einer Herzrhythmusstörung ausgewählt wurden. Es wird gezeigt, dass der beleuchtete Bereich des Herzens eine entscheidende Rolle für den Abbrucherfolg spielt und wie die gezielte Steuerung der Herzaktivität während der Beleuchtung zur Modifikation von Arrhythmiemustern erreicht werden kann. Zusammenfassend bietet diese Technik die Möglichkeit, die Mechanismusmanipulation vor Ort auf dem Weg zur Echtzeit-Feedback-Kontrolle des Herzrhythmus zu optimieren und in Bezug auf die Regionsspezifität neue Ansätze zur Reduzierung der potenziellen Schädigung des Herzsystems im Vergleich zur Verwendung von unspezifischen elektrischen Schlaganwendungen zu entwickeln.
Introduction
Frühe Untersuchungen der räumlich-zeitlichen Dynamik bei Arrhythmien zeigten, dass die komplexen elektrischen Muster beim Herzflimmern durch wirbelartig rotierende Erregungswellen angetrieben werden1. Dieser Befund lieferte neue Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen von Arrhythmien, die dann zur Entwicklung neuartiger elektrischer Terminationstherapien führten, die auf der Multi-Site-Anregung des Myokards 2,3,4 basieren. Behandlungen mit elektrischer Feldstimulation sind jedoch nicht lokal und können alle umliegenden erregbaren Zellen, einschließlich Muskelgewebe, innervieren, was zu Zell- und Gewebeschäden sowie zu unerträglichen Schmerzen führt. Im Gegensatz zu elektrischen Therapien bieten optogenetische Ansätze eine spezifische und gewebeschützende Technik, um Kardiomyozyten-Aktionspotentiale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu evozieren. Daher hat die optogenetische Stimulation das Potenzial zur minimalinvasiven Kontrolle der chaotischen Aktivierungsmuster während des Herzflimmerns.
Die Einführung des lichtempfindlichen Ionenkanalkanals Rhodopsin-2 (ChR2) in erregbare Zellen durch genetische Manipulation 5,6,7 ermöglichte die Depolarisation des Membranpotentials erregbarer Zellen mittels Photostimulation. Mehrere medizinische Anwendungen, einschließlich der Aktivierung neuronaler Netzwerke, der Kontrolle der Herzaktivität, der Wiederherstellung von Seh- und Hörvermögen, der Behandlung von Rückenmarksverletzungen und anderen 8,9,10,11,12,13,14 wurden entwickelt. Die Anwendung von ChR2 in der Kardiologie hat aufgrund seiner Millisekunden-Reaktionszeit15 ein erhebliches Potenzial und eignet sich daher gut zur gezielten Steuerung der arrhythmischen Herzdynamik.
In dieser Studie wird die Multi-Site-Photostimulation intakter Herzen eines transgenen Mausmodells gezeigt. Zusammenfassend wurde im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) eine transgene alpha-MHC-ChR2-Mauslinie etabliert und freundlicherweise von Prof. S. E. Lehnart zur Verfügung gestellt. Im Allgemeinen wurden transgene erwachsene männliche C57/B6/J, die Cre-Rekombinase unter Kontrolle von alpha-MHC exprimieren, gepaart, um sich mit dem weiblichen B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J zu paaren. Da die kardiale STOP-Kassette in der zweiten Generation gelöscht wurde, zeigten die Nachkommen eine stabile MHC-ChR2-Expression und wurden zur Aufrechterhaltung kardialer lichtempfindlicher Kolonien verwendet. Alle Experimente wurden mit erwachsenen Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von 36 – 48 Wochen durchgeführt. Die Beleuchtung wird mit einem 3 x 3 Mikro-LED-Array erreicht, das wie in16,17 beschrieben hergestellt wird, mit der Ausnahme, dass das siliziumbasierte Gehäuse und die kurzen optischen Glasfasern nicht implementiert sind. Seine erste Verwendung in einer kardialen Anwendung findet sich in18. Ein lineares Mikro-LED-Array, das auf einer ähnlichen Fertigungstechnologie basiert, wurde als durchdringende Sonde für die Herzschrittweite19 eingesetzt. Die Mikro-LEDs sind in einem 3 x 3-Array mit einem Abstand von 550 μm angeordnet und bieten sowohl eine hohe räumliche Auflösung als auch eine hohe Strahlungsleistung auf einer sehr kleinen Fläche. Die Autoren demonstrieren in dieser Arbeit eine vielseitige lokale Multi-Site-Photostimulation, die den Weg für die Entwicklung neuartiger antiarrhythmischer Therapiemethoden ebnen kann.
Das folgende experimentelle Protokoll beinhaltet eine retrograde Langendorff-Perfusion ex vivo, bei der die kanülierte Aorta als Perfusionseinlass fungiert. Durch den angelegten Perfusionsdruck und die Herzkontraktion fließt das Perfusat durch die Koronararterien, die von der Aorta abzweigen. In der vorgestellten Arbeit wird das Herz mit einem konstanten Druckaufbau durchblutet, der durch Anheben der Perfusatreservoirs auf 1 m Höhe erreicht wird, was 73,2 mmHg entspricht, was zu einer Durchflussrate von 2,633 ± 0,583 ml / min führt. Zwei Arten von Tyrode-Lösung werden während des Experiments als Perfusat verwendet. Die reguläre Tyrode-Lösung unterstützt einen stabilen Sinusrhythmus, während die Lösung von Low-K + Tyrode mit Pinacidil gemischt wird, um die Induktion von Arrhythmien in murinen Herzen zu ermöglichen. Die Verwendung eines hexagonalen Wasserbades ermöglicht die Beobachtung des Herzens durch sechs verschiedene planare Fenster, was die Kopplung mehrerer optischer Komponenten mit weniger Verzerrung durch Brechung ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine erfolgreiche Behandlung von Herzrhythmusstörungen ist der Schlüssel zur kardialen Therapie. Die biophysikalischen Mechanismen, die der Initiierung, Aufrechterhaltung und Beendigung von Arrhythmien zugrunde liegen, sind jedoch nicht vollständig verstanden. Die Herzforschung zielt daher darauf ab, die Elektroschocktherapie in Richtung eines schonenderen Abbaus von Arrhythmien zu optimieren und dadurch die Lebensqualität der Patienten zu erhöhen 28,29,30,31.</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Marion Kunze und Tina Althaus für ihre hervorragende technische Unterstützung bei den Experimenten. Die Forschung, die zu den Ergebnissen geführt hat, wurde aus dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft RP7/2007-2013 unter der Finanzhilfevereinbarung HEALTH-F2-2009-241526 gefördert. Unterstützt wurde dies auch vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, dem DZHK e.V. (Projekt MD28), dem Partnerstandort Göttingen, dem SFB 1002 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Teilprojekt C03) und der Max-Planck-Gesellschaft. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch BrainLinks-BrainTools, Exzellenzcluster der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Förderkennzeichen EXC 1086).
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
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