Расширенное управление сердечным ритмом путем применения оптогенетической многосайтовой фотостимуляции в мышечных сердцах
Summary
В данной работе сообщается о методе управления сердечным ритмом интактных мышей мышей трансгенного каналаrhodopsin-2 (ChR2) с использованием локальной фотостимуляции с микро-светодиодной решеткой и одновременным оптическим картированием эпикардиального мембранного потенциала.
Abstract
Желудочковые тахиаритмии являются основной причиной смертности и заболеваемости во всем мире. Электрическая дефибрилляция с использованием высокоэнергетических электрических ударов в настоящее время является единственным методом лечения опасной для жизни фибрилляции желудочков. Тем не менее, дефибрилляция может иметь побочные эффекты, включая невыносимую боль, повреждение тканей и ухудшение прогноза, что указывает на значительную медицинскую необходимость в разработке более мягких стратегий управления сердечным ритмом. Помимо энергосберегающих электрических подходов, сердечная оптогенетика была введена в качестве мощного инструмента для воздействия на сердечную деятельность с использованием светочувствительных мембранных ионных каналов и световых импульсов. В настоящем исследовании будет описан надежный и действительный метод успешной фотостимуляции перфузионных неповрежденных мышечных сердец Лангендорфа, основанный на многосайтовом темпе с применением массива микросветодов (микро-LED) размером 3 x 3. Одновременное оптическое картирование волн напряжения эпикардиальной мембраны позволяет исследовать эффекты региональной стимуляции и оценивать вновь индуцированную сердечную деятельность непосредственно на месте. Полученные результаты показывают, что эффективность дефибрилляции сильно зависит от параметров, выбранных для фотостимуляции при сердечной аритмии. Будет продемонстрировано, что освещенная область сердца играет решающую роль для успеха прерывания, а также как может быть достигнут целенаправленный контроль сердечной деятельности во время освещения для изменения паттернов аритмии. Таким образом, данная методика дает возможность оптимизировать манипулирование механизмом на месте на пути к контролю обратной связи сердечного ритма в режиме реального времени и, с учетом специфики региона, новые подходы к снижению потенциального вреда для сердечной системы по сравнению с использованием неспецифических приложений электрошока.
Introduction
Ранние исследования пространственно-временной динамики при аритмии показали, что сложные электрические паттерны при фибрилляции сердца управляются вихреобразными вращающимися волнами возбуждения1. Это открытие дало новое представление об основных механизмах аритмии, что затем привело к разработке новых методов лечения электрического терминирования, основанных на многосайтовом возбуждении миокарда 2,3,4. Тем не менее, лечение с использованием стимуляции электрического поля является нелокальным и может иннервировать все окружающие возбудимые клетки, включая мышечную ткань, вызывая повреждение клеток и тканей, а также невыносимую боль. В отличие от электротерапии, оптогенетические подходы обеспечивают специфическую и тканезащитную технику для вызова потенциалов действия кардиомиоцитов с высокой пространственной и временной точностью. Таким образом, оптогенетическая стимуляция имеет потенциал для минимально инвазивного контроля хаотических паттернов активации во время фибрилляции сердца.
Введение светочувствительного канала ионного канала родопсина-2 (ChR2) в возбудимые клетки посредством генетических манипуляций 5,6,7 позволило деполяризовать мембранный потенциал возбудимых клеток с помощью фотостимуляции. Было разработано несколько медицинских приложений, включая активацию нейронных сетей, контроль сердечной деятельности, восстановление зрения и слуха, лечение травм спинного мозга и другие 8,9,10,11,12,13,14. Применение ChR2 в кардиологии имеет значительный потенциал благодаря миллисекундному времени отклика15, что делает его хорошо подходящим для целенаправленного контроля аритмической динамики сердца.
В этом исследовании показана многосайтовая фотостимуляция неповрежденных сердец трансгенной мышиной модели. Таким образом, трансгенная линия мышей альфа-MHC-ChR2 была создана в рамках Седьмой рамочной программы Европейского сообщества FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) и любезно предоставлена профессором С. Э. Ленартом. В целом, трансгенные взрослые самцы C57/B6/J, экспрессирующие Cre-рекомбиназу под контролем альфа-MHC, были спаренны для спаривания с женскими B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Поскольку сердечная стоп-кассета была удалена во втором поколении, потомство показало стабильную экспрессию MHC-ChR2 и использовалось для поддержания сердечных фоточувствительных колоний. Все эксперименты проводились со взрослыми мышами обоих полов в возрасте 36 – 48 недель. Освещение достигается с помощью микро-светодиодной решетки 3 x 3, изготовленной, как описано в16,17, за исключением того, что корпус на основе кремния и короткие оптические стеклянные волокна не реализованы. Его первое использование в кардиологическом применении обнаружено в18. Линейный микро-светодиодный массив, основанный на аналогичной технологии изготовления, был применен в качестве проникающего зонда для кардиостимуляции19. Микросветодиоды расположены в массиве 3 x 3 с шагом 550 мкм, обеспечивая как высокое пространственное разрешение, так и высокую мощность излучения на очень небольшой площади. Авторы демонстрируют в этой работе универсальную локальную многосайтовую фотостимуляцию, которая может открыть путь для разработки новых методов антиаритмической терапии.
Следующий экспериментальный протокол включает ретроградную перфузию Лангендорфа ex vivo, для которой каннулированная аорта функционирует как перфузионное входное отверстие. Из-за приложенного перфузионного давления и сердечного сокращения перфусат протекает через коронарные артерии, которые ответвляются от аорты. В представленной работе сердце перфузируется с использованием установки постоянного давления, достигаемой путем подъема резервуаров перфусата на высоту 1 м, что эквивалентно 73,2 мм рт.ст., что дает скорость потока 2,633 ± 0,583 мл/мин. Два вида раствора Тирода используются в качестве перфусата во время эксперимента. Раствор Обычного Тирода поддерживает стабильный синусовый ритм, тогда как раствор Low-K+ Tyrode смешивается с Пинацидилом, чтобы обеспечить индукцию аритмии в сердцах мышей. Использование шестиугольной водяной бани позволяет наблюдать за сердцем через шесть различных плоских окон, что позволяет соединять несколько оптических компонентов с меньшим искажением при преломлении.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешное лечение сердечных тахиаритмий является ключом к сердечной терапии. Однако биофизические механизмы, лежащие в основе инициирования, увековечения и прекращения аритмии, до конца не изучены. Поэтому кардиологические исследования направлены на оптимизацию электрошоковой терап…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Марион Кунце и Тину Альтхаус за отличную техническую поддержку во время экспериментов. Исследования, приведшие к результатам, получили финансирование от Седьмой рамочной программы Европейского сообщества FP7/2007-2013 под номером грантового соглашения HEALTH-F2-2009-241526. Поддержку также оказали Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований, DZHK e.V. (проект MD28), партнерский сайт Goettingen, Немецкий исследовательский фонд CRC 1002 (проект C03) и Общество Макса Планка. Эта работа была частично поддержана BrainLinks-BrainTools, кластером передового опыта, финансируемым Немецким исследовательским фондом (DFG, номер гранта EXC 1086).
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
References
- Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
- Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
- Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
- Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
- Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
- Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
- Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
- Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
- Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. , 5252-5255 (2014).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. , 162-165 (2015).
- Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light – From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. , 4832-4835 (2018).
- Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
- . mouser.de, LED Engin, [Online] Available from: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208 (2020)
- . thorlabs.com, thorlabs, [Online] Available from: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020)
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
- Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
- Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
- Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
- Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. , 345-348 (2010).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
- Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
- O’Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping – Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
- Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
- Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
- Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
- Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
- Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
- Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
- Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
- Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
- Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
- Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).
