Summary

Extração de ganglioside, purificação e perfil

Published: March 12, 2021
doi:

Summary

Gangliosides são glicósfoliópidos portadores de ácido sálico que são particularmente abundantes no cérebro. Sua natureza anfíppática requer técnicas orgânicas/aquosas de extração e purificação para garantir uma recuperação ideal e análises precisas. Este artigo fornece visões gerais da extração de ganglioside em escala analítica e preparatória, purificação e análise de cromatografia de camada fina.

Abstract

Gangliosides são glicosfingolipidos que contêm um ou mais resíduos de ácido sálico. Eles são encontrados em todas as células vertebrados e tecidos, mas são especialmente abundantes no cérebro. Expressos principalmente no folheto externo das membranas plasmáticas das células, eles modulam as atividades das proteínas da superfície celular via associação lateral, atuam como receptores nas interações células-células e são alvos de patógenos e toxinas. A desregulação genética da biossíntese ganglioside em humanos resulta em graves distúrbios do sistema nervoso congênito. Devido à sua natureza anfípppica, a extração, a purificação e a análise de gangliosides exigem técnicas que foram otimizadas por muitos investigadores nos 80 anos desde sua descoberta. Aqui, descrevemos métodos de nível de bancada para a extração, purificação e análises qualitativas e quantitativas preliminares de grandes gangliosides de tecidos e células que podem ser completadas em poucas horas. Também descrevemos métodos para isolamento em maior escala e purificação de grandes espécies de ganglioside do cérebro. Juntos, esses métodos proporcionam acesso analítico e de escala preparatória a essa classe de moléculas bioativas.

Introduction

Os gangliosides são definidos como glicosfingolipids com um ou mais resíduos de ácido sálico1. Eles são expressos principalmente na superfície celular com sua moiety lipídica de ceramida hidrofóbica incorporada no folheto externo da membrana plasmática e seus glicanos hidrofílicos estendendo-se para o espaço extracelular2. Embora amplamente distribuídas em células vertebradas e tecidos, elas são particularmente abundantes no cérebro vertebrado3, onde foram descobertos pela primeira vez e nomeados4.

As estruturas dos glicanos gangliosas variam e são a base para sua nomenclatura (Figura 1). Os glicanos ganglios são compostos por um núcleo de açúcar neutro com diferentes números e distribuições de ácidos sálicos. O menor ganglioside, GM4, tem apenas dois açúcares (ácido sálico ligado à galactose)5. Gangliosides maiores e naturais podem conter bem mais de uma dúzia de açúcares totais6 ou até sete ácidos sálicos em um único núcleo neutro7. Seus moieties lipídios de ceramida também variam, tendo diferentes comprimentos de sphingosina e uma variedade de amides de ácido graxo. No cérebro vertebrado predominam quatro espécies de ganglioside, GM1, GD1a, GD1b e GT1b. A expressão ganglioside é regulada pelo desenvolvimento, específica do tecido e tipo celular específico.

Figure 1
Figura 1: Grandes gângsteres cerebrais e seus precursores biossintéticos. As estruturas são mostradas usando a nomenclatura de símbolos para Glycans11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os ganglios funcionam no nível molecular ao engajar e modular proteínas em suas próprias membranas (regulação cis) ou por envolver proteínas de ligação glica no meio extracelular, incluindo toxinas bacterianas e lectinas em outras células (reconhecimento trans)3. A ligação específica de gangliosides a proteínas regulatórias e/ou auto-associação com outras moléculas em vigas lipídicas resulta em mudanças no comportamento celular que impactam a estrutura e função do sistema nervoso, progressão do câncer, metabolismo, inflamação, proteinopatias neuronais e doenças infecciosas8. Devido às suas diversas funções celulares, os métodos para seu isolamento e análise podem fornecer insights aprimorados sobre a regulação dos processos fisiológicos e patológicos. Aqui, são fornecidos métodos validados para extração e análise rápida em pequena escala e isolamento em escala preparatória de gangliosides do cérebro. São discutidas oportunidades e desafios para a aplicação a outros tecidos.

Protocol

A coleta de tecidos foi realizada em condições autorizadas pelo Comitê de Uso e Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins. 1. Extração de ganglioside em pequena escala e purificação parcial ATENÇÃO: Tenha ventilação adequada ao trabalhar com solventes voláteis e tóxicos. Evite o plástico por toda parte; solventes extrairão componentes químicos de muitos plásticos que interferem com análises subsequentes. Politetrafluoroetileno (PTFE) é uma exceção; …

Representative Results

Os métodos descritos na seção 1 (pequena escala) fornecem gangliosides em quantidade e pureza suficientes para a determinação qualitativa e quantitativa de grandes lesões cerebrais. A recuperação do cérebro do camundongo é ~ 1 μmol ganglioside por g peso molhado cerebral (1 nmol/μL) quando preparado como descrito. A resolução TLC de 1 μL (1 nmol) usando a seção 3 fornece material amplo para detecção de resorcinol e resolve todos os principais gangliodolos cerebrais como mostrado para o tipo selvagem e …

Discussion

Os métodos de extração e isolamento de ganglioside de pequeno e grande porte relatados aqui não são únicos – existem muitas abordagens diferentes de extração e purificação de solventes que fornecem excelentes resultados12. Os métodos relatados aqui para purificação em pequena escala do cérebro, de Fredman e Svennerholm13, mostraram-se para otimizar a recuperação e provaram ser robustos e diretos ao longo de muitos anos em nosso laboratório. O isolamento e p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Comum dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para a concessão da Glicociência U01CA241953. O MJP foi apoiado pelo Programa de Interface Química-Biologia da Johns Hopkins (T32GM080189).

Materials

Bovine brain, stripped PelFreez 57105-1
Ganglioside standards Matreya GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Glass bottle with PTFE-lined cap Fisher Scientific 02-911-739
Glass centrifuge bottle Fisher Scientific 05-586B
Glass culture tubes, 16 x 125 mm VWR 60825-430 for collecting HPLC fractions
Glass separatory funnel (2 L) Pyrex 6400-2L
Injection syringe – Hamilton 1750 gastight 500 µl Hamilton 81265
p-Anisaldehyde, 98% Sigma-Aldrich  A88107
Potter-Elvhjem Homogenizer Fisher Scientific 08-414-14A Choose appropriate volume option
Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns Analytics-Shop AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column Analytics-Shop custom packed other sizes available
Resorcinol Sigma-Aldrich 30752-1
Rotary evaporator Buchi R-300
Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) Sigma-Aldrich 57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) Waters WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg Waters WAT036810
Spotting syringe – Hamilton 701N 10 µl Hamilton 80300
Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps Fisher Scientific 14-933A
Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps Fisher Scientific 14-955-323 For ganglioside storage
TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat Fisher Scientific M1056350001 Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface
TLC reagent sprayer Fisher Scientific 05-723-26A
TLC running chamber for 10 x 10 cm plates Camag 22.5155
Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender Waring E8520

References

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Cite This Article
Porter, M. J., Zhang, G., Schnaar, R. L. Ganglioside Extraction, Purification and Profiling. J. Vis. Exp. (169), e62385, doi:10.3791/62385 (2021).

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