Ganglioside Ekstraksiyonu, Saflaştırma ve Profilleme
Summary
Gangliosidler, beyinde özellikle bol miktarda bulunan sialik asit taşıyan glikozfingolipidlerdir. Amfipatik doğaları, optimum geri kazanım ve doğru analizler sağlamak için organik / sulu ekstraksiyon ve saflaştırma teknikleri gerektirir. Bu makalede, analitik ve hazırlayıcı ölçekli ganglioside ekstraksiyonu, saflaştırma ve ince tabaka kromatografisi analizine genel bakış sunulmaktadır.
Abstract
Gangliosidler, bir veya daha fazla sialik asit kalıntısı içeren glikozfingolipidlerdir. Tüm omurgalı hücrelerinde ve dokularında bulunurlar, ancak özellikle beyinde bol miktarda bulunurlar. Öncelikle hücrelerin plazma zarlarının dış broşüründe ifade edilen, hücre yüzey proteinlerinin faaliyetlerini lateral ilişki yoluyla modüle eder, hücre-hücre etkileşimlerinde reseptör görevi görür ve patojenler ve toksinler için hedeflerdir. İnsanlarda gangliosid biyosentezinin genetik disregülasyonu ciddi konjenital sinir sistemi bozukluklarına neden olur. Amfipatik doğaları nedeniyle, gangliosidlerin ekstraksiyonu, saflaştırılması ve analizi, keşiflerinden bu yana geçen 80 yıl içinde birçok araştırmacı tarafından optimize edilmiş teknikler gerektirir. Burada, birkaç saat içinde tamamlanabilen dokulardan ve hücrelerden majör gangliosidlerin ekstraksiyonu, saflaştırılması ve ön kalitatif ve kantitatif analizleri için tezgah düzeyinde yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, büyük ganglioside türlerinin beyinden daha büyük ölçekli izolasyonu ve saflaştırılması için yöntemler de açıklıyoruz. Birlikte, bu yöntemler bu biyoaktif molekül sınıfına analitik ve hazırlayıcı ölçek erişimi sağlar.
Introduction
Gangliosidler, bir veya daha fazla sialik asit kalıntısı taşıyan glikozfingolipidler olarak tanımlanır1. Plazma zarının dış broşürüne gömülü hidrofobik seramid lipid köstebekleri ve hücre dışı boşluğa uzanan hidrofilik glikanları ile öncelikle hücre yüzeyinde eksprese edilirler2. Omurgalı hücrelerinde ve dokularında yaygın olarak dağılmış olmalarına rağmen, ilk keşfedildikleri ve adlandırıldıkları omurgalı beyninde3 özellikle bol miktarda bulunurlar4.
Gangliosid glikanlarının yapıları değişir ve isimlendirmelerinin temelidir (Şekil 1). Ganglioside glikanları, sialik asitlerin farklı sayılarını ve dağılımlarını taşıyan nötr bir şeker çekirdeğinden oluşur. En küçük ganglioside olan GM4, sadece iki şekere sahiptir (galaktoza bağlı sialik asit)5. Doğal olarak oluşan daha büyük gangliosidler, tek bir nötr çekirdek üzerinde bir düzineden fazla toplam şeker6 veya yedi adede kadar sialik asit içerebilir7. Seramid lipit moieties de farklı sfingozin uzunluklarına ve çeşitli yağ asidi amidlerine sahip olarak değişir. Omurgalı beyninde dört ganglioside türü, GM1, GD1a, GD1b ve GT1b baskındır. Ganglioside ekspresyonu gelişimsel olarak düzenlenir, dokuya özgüdür ve hücre tipine özgüdür.
Şekil 1: Majör beyin gangliyozları ve biyosentetik öncülleri. Yapılar, Glikanlar için Sembol İsimlendirmesi kullanılarak gösterilmiştir11. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Gangliosidler, proteinleri kendi zarlarına bağlayarak ve modüle ederek (cis regülasyonu) veya bakteriyel toksinler ve diğer hücrelerdeki lektinler de dahil olmak üzere hücre dışı ortamda glikan bağlayıcı proteinleri devreye sokarak moleküler düzeyde işlev görür (trans tanıma)3. Gangliosidlerin düzenleyici proteinlere spesifik bağlanması ve / veya diğer moleküllerle lipit sallarına kendi kendine bağlanması, sinir sistemi yapısını ve işlevini, kanser progresyonunu, metabolizmayı, inflamasyonu, nöronal proteinopatileri ve bulaşıcı hastalıkları etkileyen hücre davranışında değişikliklere neden olur8. Çeşitli hücresel rolleri nedeniyle, izolasyon ve analiz yöntemleri, fizyolojik ve patolojik süreçlerin düzenlenmesi konusunda gelişmiş bilgiler sağlayabilir. Burada, hızlı küçük ölçekli ekstraksiyon ve analiz için doğrulanmış yöntemler ve gangliosidlerin beyinden preparatif ölçekli izolasyonu sağlanmaktadır. Diğer dokulara uygulama fırsatları ve zorlukları tartışılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bildirilen küçük ve büyük ölçekli gangliosid ekstraksiyonu ve izolasyonu yöntemleri benzersiz değildir – mükemmel sonuçlar veren birçok farklı çözücü ekstraksiyonu ve saflaştırma yaklaşımı vardır12. Burada beyinden, Fredman ve Svennerholm’dan13 küçük ölçekli saflaştırma için bildirilen yöntemlerin iyileşmeyi optimize ettiği ve laboratuvarımızda uzun yıllar boyunca sağlam ve basit olduğu kanıtlanmıştır. TLC ve MS için uygun …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Glikobilim Ortak Fonu hibesi U01CA241953 tarafından desteklenmiştir. MJP, Johns Hopkins’teki Kimya-Biyoloji Arayüz Programı (T32GM080189) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe – Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe – Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
- Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
- Schnaar, R. L. Gangliosides of the vertebrate nervous system. Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).
- Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
- Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
- Nimrichter, L., et al. E-selectin receptors on human leukocytes. Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).
- Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
- Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
- Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
- Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
- Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
- Schnaar, R. L. Isolation of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).
- Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
- Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
- Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
- Schnaar, R. L., Needham, L. K. Thin-layer chromatography of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).
- Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
- Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).
