Antivirale Hochdurchsatz-Assays zum Screening auf Inhibitoren der Zika-Virusreplikation
Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir die Protokolle, die in replikonbasierten und viralen enzymbasierten Assays verwendet werden, um in einem Hochdurchsatz-Screening-Format nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen.
Abstract
Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger biochemischer und zellulärer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten (HTS) durchgeführt werden können. Es wird angenommen, dass sich die nichtstrukturellen Flavivirusproteine (NS) kotranslational auf den endoplasmatischen Retikulummembranen (ER) zusammensetzen und den Replikationskomplex (RC) bilden. Die NS3 und NS5 sind die am besten untersuchten Enzyme der RC und stellen aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Replikation des viralen Genoms die Hauptziele für die Arzneimittelentwicklung dar. Die NS3-Proteasedomäne, die NS2B als Cofaktor benötigt, ist für die Spaltung des unreifen viralen Polyproteins in die reifen NS-Proteine verantwortlich, während die NS5 RdRp-Domäne für die RNA-Replikation verantwortlich ist. Hierin beschreiben wir detailliert die Protokolle, die in replicon-basierten Screenings und enzymatischen Assays verwendet werden, um große Verbindungsbibliotheken auf Inhibitoren der Zika-Virus-Replikation (ZIKV) zu testen. Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Reporterproteinaktivität gemessen wird. Die replicon-basierten Screenings wurden mit einer BHK-21 ZIKV Replicon Zelllinie durchgeführt, die Renilla Luciferase als Reportergen exprimierte. Um die spezifischen Ziele der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in-vitro-fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease und NS5 RdRp etabliert. Die proteolytische Aktivität der viralen Protease wurde unter Verwendung des fluorogenen Peptidsubstrats Bz-nKRR-AMC gemessen, während die NS5 RdRp-Dehnungsaktivität direkt durch die Erhöhung des fluoreszierenden Signals von SYBR Green I während der RNA-Elongation unter Verwendung der synthetischen biotinylierten selbstansaugenden Vorlage 3′UTR-U30 (5′-Biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′) nachgewiesen wurde.
Introduction
Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein neu auftretendes arthropodenübertragenes Virus, das zur Gattung Flavivirusgehört, zu der das eng verwandte Dengue-Virus (DENV), das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) und das Gelbfiebervirus (YFV) gehören, die eine ständige Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellen1. Der ZIKV-Ausbruch 2015-16 in Amerika erhielt weltweite Aufmerksamkeit nach seinem Auftreten in Brasilien aufgrund der Assoziation mit schweren neurologischen Störungen, wie angeborener ZIKV-assoziierter Mikrozephalie bei Neugeborenen2,3 und Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen4. Obwohl die Zahl der Infektionsfälle in den nächsten zwei Jahren zurückging, wurden autochthone durch Mücken übertragene Übertragungen von ZIKV im Jahr 2019 in 87 Ländern und Gebieten nachgewiesen, was das Potenzial des Virus belegt, als Epidemie wieder aufzutauchen5. Bis heute gibt es keine zugelassenen Impfstoffe oder wirksamen Medikamente gegen ZIKV-Infektionen.
Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger zellulärer und biochemischer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten (HTS) durchgeführt werden können. Replicon-basierte Screenings und virale enzymbasierte Assays sind zwei wertvolle Strategien, um niedermolekulare Verbindungen auf Inhibitoren von ZIKV1zu testen. Es wird angenommen, dass sich die nichtstrukturellen Flavivirusproteine (NS) kotranslational auf den endoplasmatischen Retikulummembranen (ER) zusammensetzen und den Replikationskomplex (RC)bilden 6. Die NS3 und NS5 sind die am besten untersuchten Enzyme der RC und stellen aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Replikation des viralen Genoms die Hauptziele für die Arzneimittelentwicklung dar. Die NS3-Proteasedomäne, die NS2B als Cofaktor benötigt, ist für die Spaltung des unreifen viralen Polyproteins in die reifen NS-Proteine verantwortlich, während die NS5 RdRp-Domäne für die RNA-Replikation verantwortlich ist6.
Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Reporterproteinaktivität gemessen wird7. Hierin beschreiben wir die Protokolle, die für screening-Inhibitoren der ZIKV-Replikation in einem 96-Well-Plattenformat verwendet werden. Die Replicon-basierten Assays wurden mit einer BHK-21 ZIKV Rluc Replicon Zelllinie durchgeführt, die wir kürzlich entwickelt haben8. Um die spezifischen Targets der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in vitro fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease unter Verwendung des fluorogenen Peptidsubstrats Bz-nKRR-AMC etabliert, während wir für NS5 RdRp die Dehnung der synthetischen biotinylierten selbstansaugenden Schablone 3′UTR-U30 (5′-Biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′) mit dem interkalierenden Farbstoff SYBR Green I gemessen haben.
Die ZIKV-Protease (45-96 Rückstände des NS2B-Cofaktors, die mit den Rückständen 1-177 der NS3-Proteasedomäne durch einen glycinreichen Linker[G4SG4])verbunden sind, wurde wie für YFV9beschrieben erhalten, während die Polymerase (276-898 Rückstände der RdRp-Domäne) geklont und exprimiert wurde, wie in10beschrieben. Beide Enzymsequenzen wurden von GenBank ALU33341.1 abgeleitet. Als primäre antivirale Screenings werden Verbindungen bei 10 μM getestet und diejenigen, die Aktivitäten ≥ 80% zeigen, werden dann dosisabhängig bewertet, was zu den Effektiv-/Hemmungs- (EC50 oder IC50)und den zytotoxischen (CC50)Konzentrationen führt. Im Rahmen repräsentativer Ergebnisse werden die EC50- und CC50-Werte von NITD008, einem bekannten Flavivirusinhibitor11,aus replicon-basierten Screenings gezeigt. Für die enzymatischen Assays werden die IC50-Werte von zwei Verbindungen aus der MMV/DNDi Pandemic Response Box, einer Bibliothek aus 400 Molekülen mit antibakteriellen, antimykotischen und antiviralen Aktivitäten, gezeigt. Die in dieser Arbeit beschriebenen Protokolle könnten modifiziert werden, um nach Inhibitoren anderer verwandter Flaviviren zu suchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Protokolle könnten leicht für Screenings in einem 384- oder 1536-Well-Format angepasst werden. Für biochemische und/oder zellbasierte Screenings, die im HTS-Format durchgeführt werden, wird der Z’-Faktorwert, ein statistischer Parameter, für jede Platte berechnet, um die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit dieser Assays sicherzustellen12. Für replicon-basierte Screenings wird ein Z’-Faktorwert von 0,5 oder mehr erwartet, während für die NS3- und NS5-A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID Grant 2013/07600-3 an GO, Grant 2018/05130-3 an RSF und 2016/19712-9 an ASG und Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Grant 88887.516153/2020-00) an ASG. Wir danken der Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) und der Drugs for Neglected Diseases Initiative (DNDi, www.dndi.org) für ihre Unterstützung, das Design der Pandemic Response Box und die Lieferung der Wirkstoffe.
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
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