Высокопроизводительный противовирусный анализ для скрининга ингибиторов репликации вируса Зика
Summary
В этой работе мы описываем протоколы, используемые в анализах на основе репликона и вирусных ферментов для скрининга ингибиторов репликации вируса Зика в высокопроизводительном формате скрининга.
Abstract
Открытие противовирусных препаратов требует разработки надежных биохимических и клеточных анализов, которые могут быть выполнены в форматах высокопроизводительного скрининга (HTS). Считается, что флавивирусные неструктурные (NS) белки совместно-трансляционно собираются на мембранах эндоплазматического ретикулума (ER), образуя компликационный комплекс (RC). NS3 и NS5 являются наиболее изученными ферментами RC и являются основными мишенями для разработки лекарств из-за их решающей роли в репликации вирусного генома. Домен протеазы NS3, который требует NS2B в качестве кофактора, отвечает за расщепление незрелого вирусного полипротеина на зрелые белки NS, тогда как домен NS5 RdRp отвечает за репликацию РНК. Здесь мы подробно описываем протоколы, используемые в скринингах на основе репликонов и ферментативных анализах для тестирования больших библиотек соединений на ингибиторы репликации вируса Зика (ZIKV). Репликоны представляют собой самовоспроизводящиеся субгеномные системы, экспрессируемые в клетках млекопитающих, в которых вирусные структурные гены заменяются репортерным геном. Ингибирующее воздействие соединений на репликацию вирусной РНК можно легко оценить, измерив снижение активности репортерного белка. Скрининги на основе репликона проводились с использованием клеточной линии репликона BHK-21 ZIKV, экспрессирующей люциферазу Renilla в качестве гена-репортера. Чтобы охарактеризовать конкретные мишени идентифицированных соединений, мы установили анализы на основе флуоресценции in vitro для рекомбинантно экспрессированной протеазы NS3 и NS5 RdRp. Протеолитическую активность вирусной протеазы измеряли с помощью фторогенного пептидного субстрата Bz-nKRR-AMC, в то время как активность элонгации NS5 RdRp непосредственно обнаруживалась увеличением флуоресцентного сигнала SYBR Green I при удлинении РНК с использованием синтетического биотинилированного самовсасывающего шаблона 3′UTR-U30 (5′-биотин-U30-ACUGGAGAUCGAUCCAGU-3′).
Introduction
Вирус Зика (ZIKV) является новым членом переносимого членистоногогого вируса рода Flavivirus,который включает в себя тесно связанный вирус денге (DENV), вирус японского энцефалита (JEV) и вирус желтой лихорадки (YFV), которые представляют постоянную угрозу для общественного здравоохранения1. Вспышка ZIKV в 2015-16 годах в Северной и Южной Америке привлекла глобальное внимание после ее появления в Бразилии из-за связи с тяжелыми неврологическими расстройствами, такими как врожденная микроцефалия, связанная с ZIKV, у новорожденных2,3 и синдром Гийена-Барре у взрослых4. Хотя число случаев заражения снизилось в течение следующих двух лет, автохтонные передачи ZIKV, переносимые комарами, были проверены в 87 странах и территориях в 2019 году, что свидетельствует о потенциале вируса вновь появиться в качестве эпидемии5. На сегодняшний день не существует одобренных вакцин или эффективных препаратов против инфекции ZIKV.
Открытие противовирусных препаратов требует разработки надежных клеточных и биохимических анализов, которые могут быть выполнены в форматах высокопроизводительного скрининга (HTS). Скрининги на основе Replicon и анализы на основе вирусных ферментов являются двумя ценными стратегиями тестирования маломолекулярных соединений на ингибиторы ZIKV1. Считается, что флавивирусные неструктурные (NS) белки совместно-трансляционно собираются на мембранах эндоплазматического ретикулума (ER), образуя комплекс репликации (RC)6. NS3 и NS5 являются наиболее изученными ферментами RC и являются основными мишенями для разработки лекарств из-за их решающей роли в репликации вирусного генома. Протеазный домен NS3, который требует NS2B в качестве кофактора, отвечает за расщепление незрелого вирусного полипротеина на зрелые белки NS, тогда как домен NS5 RdRp отвечает за репликацию РНК6.
Репликоны представляют собой самовоспроизводящиеся субгеномные системы, экспрессируемые в клетках млекопитающих, в которых вирусные структурные гены заменяются репортерным геном. Ингибирующее действие соединений на репликацию вирусной РНК можно легко оценить, измерив снижение активности репортерного белка7. Здесь описываются протоколы, используемые для скрининга ингибиторов репликации ZIKV в формате пластины 96 скважин. Анализы на основе репликона были выполнены с использованием клеточной линии BHK-21 ZIKV Rluc, которую мы недавно разработали8. Для характеристики конкретных мишеней идентифицированных соединений мы установили анализы на основе флуоресценции in vitro для рекомбинантно экспрессированной протеазы NS3 с использованием фторогенного пептидного субстрата Bz-nKRR-AMC, тогда как для NS5 RdRp мы измерили удлинение синтетического биотинилированного самовсасывающего шаблона 3′UTR-U30 (5′-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCCAGU-3′), используя интеркаляционный краситель SYBR Green I.
Протеазу ZIKV (45-96 остатков кофактора NS2B, связанного с остатками 1-177 протеазного домена NS3 богатым глицином линкером[G4SG4]),как описано для YFV9,в то время как полимеразу (276-898 остатков домена RdRp) клонировали и экспрессировали, как описано в10. Обе последовательности ферментов были получены из GenBank ALU33341.1. В качестве первичных противовирусных скринингов соединения тестируют при 10 мкМ, а те, которые показывают активность ≥ 80%, затем оценивают дозозависимым образом, что приводит к эффективному/ингибированию (EC50 или IC50)и цитотоксическим (CC50)концентрациям. В контексте репрезентативных результатов показаны значения EC50 и CC50 NITD008, известного ингибитора флавивирусов11,из скринингов на основе репликона. Для ферментативных анализов показаны значения IC50 двух соединений из MMV/DNDi Pandemic Response Box, библиотеки, состоящей из 400 молекул с антибактериальной, противогрибковой и противовирусной активностью. Протоколы, описанные в этой работе, могут быть модифицированы для скрининга ингибиторов других родственных флавивирусов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы, описанные в настоящем описании, могут быть легко адаптированы для скрининга в форматах 384 или 1536 скважин. Для биохимических и/или клеточных скринингов, выполняемых в формате HTS, значение Z’ factor, статистический параметр, рассчитывается для каждой пластины для обеспечения чувст?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом Ампаро в Пескизе сан-Паулу (FAPESP), грантом CEPID 2013/07600-3 для GO, грантом 2018/05130-3 для RSF и 2016/19712-9 для ASG и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (грант 88887.516153/2020-00) для ASG. Мы хотели бы с благодарностью поблагодарить Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) и инициативу «Лекарства от забытых болезней» (DNDi, www.dndi.org) за их поддержку, разработку Блока реагирования на пандемию и поставку соединений.
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
References
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
- Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
- Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
- Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
- Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
- Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
- Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
- Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
- Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
- Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
- Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
- Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
- Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
- Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
- Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
- Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
- Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
- Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
- Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
- Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
- Simeonov, A., Davis, M. I. . Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
- Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
- Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
- Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).
