Saggi antivirali ad alto rendimento per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika
Summary
In questo lavoro, descriviamo i protocolli utilizzati nei saggi basati su enzimi replicon e virali per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika in un formato di screening ad alto rendimento.
Abstract
La scoperta di farmaci antivirali richiede lo sviluppo di saggi biochimici e cellulari affidabili che possono essere eseguiti in formati di screening ad alto rendimento (HTS). Si ritiene che le proteine non strutturali (NS) del flavivirus si assemblino co-traduzionalmente sulle membrane del reticolo endoplasmatico (ER), formando il complesso di replicazione (RC). NS3 e NS5 sono gli enzimi più studiati della RC e costituiscono i principali bersagli per lo sviluppo di farmaci a causa dei loro ruoli cruciali nella replicazione del genoma virale. Il dominio della proteasi NS3, che richiede NS2B come cofattore, è responsabile della scissione della poliproteina virale immatura nelle proteine NS mature, mentre il dominio NS5 RdRp è responsabile della replicazione dell’RNA. Qui descriviamo in dettaglio i protocolli utilizzati negli screening basati su replicon e nei saggi enzimatici per testare grandi librerie di composti per inibitori della replicazione del virus Zika (ZIKV). I repliconi sono sistemi subgenomici autoreplicanti espressi in cellule di mammifero, in cui i geni strutturali virali sono sostituiti da un gene reporter. Gli effetti inibitori dei composti sulla replicazione dell’RNA virale possono essere facilmente valutati misurando la riduzione dell’attività della proteina reporter. Gli screening basati su replicon sono stati eseguiti utilizzando una linea cellulare replicon ZIKV BHK-21 che esprime Renilla luciferasi come gene reporter. Per caratterizzare i bersagli specifici dei composti identificati, abbiamo stabilito saggi in vitro basati sulla fluorescenza per la proteasi NS3 e NS5 RdRp espressi in modo ricombinante. L’attività proteolitica della proteasi virale è stata misurata utilizzando il substrato peptidico fluorogenico Bz-nKRR-AMC, mentre l’attività di allungamento di NS5 RdRp è stata rilevata direttamente dall’aumento del segnale fluorescente di SYBR Green I durante l’allungamento dell’RNA, utilizzando il modello autoadescante biotinilato sintetico 3′UTR-U30 (5′-biotina-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′).
Introduction
Il virus Zika (ZIKV) è un virus emergente trasmesso da artropodi membro del genere Flavivirus, che comprende il virus Dengue strettamente correlato (DENV), il virus dell’encefalite giapponese (JEV) e il virus della febbre gialla (YFV), che rappresentano costanti minacce per la salute pubblica1. L’epidemia di ZIKV del 2015-16 nelle Americhe ha ricevuto un’attenzione globale in seguito alla sua comparsa in Brasile a causa dell’associazione con gravi disturbi neurologici, come la microcefalia congenita associata a ZIKV nei neonati2,3 e la sindrome di Guillain-Barré negli adulti4. Sebbene il numero di casi di infezione sia diminuito nei prossimi due anni, le trasmissioni autoctone trasmesse dalle zanzare di ZIKV sono state verificate in 87 paesi e territori nel 2019, evidenziando quindi il potenziale del virus di riemergere come epidemia5. Ad oggi, non ci sono vaccini approvati o farmaci efficaci contro l’infezione da ZIKV.
La scoperta di farmaci antivirali richiede lo sviluppo di saggi cellulari e biochimici affidabili che possono essere eseguiti in formati di screening ad alto rendimento (HTS). Gli screening basati su Replicon e i saggi basati su enzimi virali sono due strategie preziose per testare composti a piccole molecole per gli inibitori di ZIKV1. Si ritiene che le proteine non strutturali (NS) del flavivirus si assemblino co-traduzionalmente sulle membrane del reticolo endoplasmatico (ER), formando il complesso di replicazione (RC)6. NS3 e NS5 sono gli enzimi più studiati della RC e costituiscono i principali bersagli per lo sviluppo di farmaci a causa dei loro ruoli cruciali nella replicazione del genoma virale. Il dominio della proteasi NS3, che richiede NS2B come cofattore, è responsabile della scissione della poliproteina virale immatura nelle proteine NS mature, mentre il dominio NS5 RdRp è responsabile della replicazione dell’RNA6.
I repliconi sono sistemi subgenomici autoreplicanti espressi in cellule di mammifero, in cui i geni strutturali virali sono sostituiti da un gene reporter. Gli effetti inibitori dei composti sulla replicazione dell’RNA virale possono essere facilmente valutati misurando la riduzione dell’attività della proteina reporter7. Qui descriviamo i protocolli utilizzati per lo screening degli inibitori della replicazione ZIKV in un formato di piastra a 96 pozzetti. I saggi basati su replicon sono stati eseguiti utilizzando una linea cellulare BHK-21 ZIKV Rluc replicon che abbiamo recentemente sviluppato8. Per caratterizzare i bersagli specifici dei composti identificati, abbiamo stabilito saggi in vitro basati sulla fluorescenza per la proteasi NS3 espressa in modo ricombinante utilizzando il substrato peptidico fluorogenico, Bz-nKRR-AMC, mentre per NS5 RdRp abbiamo misurato l’allungamento del modello autoadescante biotinilato sintetico 3′UTR-U30 (5′-biotina-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′), utilizzando il colorante intercalante SYBR Green I.
La proteasi ZIKV (45-96 residui di cofattore NS2B legati ai residui 1-177 del dominio proteasi NS3 da un linker ricco di glicina [G4SG4]) è stata ottenuta, come descritto per YFV9, mentre la polimerasi (276-898 residui del dominio RdRp) è stata clonata ed espressa, come dettagliato in10. Entrambe le sequenze enzimatiche sono state derivate da GenBank ALU33341.1. Come screening antivirali primari, i composti vengono testati a 10 μM e quelli che mostrano attività ≥ l’80% vengono quindi valutati in modo dose-dipendente, con conseguente efficacia/inibizione (EC50 o IC50)e concentrazioni citotossiche (CC50). Nel contesto di risultati rappresentativi, vengono mostrati i valori EC50 e CC50 di NITD008, un noto inibitore dei flavivirus11, da screening basati su replicon. Per i saggi enzimatici vengono mostrati i valori IC50 di due composti della MMV/DNDi Pandemic Response Box, una libreria composta da 400 molecole con attività antibatterica, antimicotica e antivirale. I protocolli descritti in questo lavoro potrebbero essere modificati per lo screening degli inibitori di altri flavivirus correlati.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli qui descritti potrebbero essere facilmente adattati per le proiezioni in un formato a 384 o 1536 pozze. Per gli screening biochimici e/o cellulari eseguiti in formato HTS, il valore del fattore Z’, un parametro statistico, viene calcolato per ciascuna piastra per garantire la sensibilità, la riproducibilità e l’accuratezza di tali saggi12. Un valore del fattore Z’ di 0,5 o superiore è previsto per gli screening basati su replicon, mentre un valore di 0,7 o superiore è previsto per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), sovvenzione CEPID 2013/07600-3 a GO, sovvenzione 2018/05130-3 a RSF e 2016/19712-9 ad ASG, e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (sovvenzione 88887.516153/2020-00) ad ASG. Vorremmo ringraziare con gratitudine la Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) e l’iniziativa Drugs for Neglected Diseases (DNDi, www.dndi.org) per il loro supporto, la progettazione della Pandemic Response Box e la fornitura dei composti.
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
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