Ensayos antivirales de alto rendimiento para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika
Summary
En este trabajo, describimos los protocolos utilizados en los ensayos basados en replicon y en enzimas virales para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika en un formato de detección de alto rendimiento.
Abstract
El descubrimiento de fármacos antivirales requiere el desarrollo de ensayos bioquímicos y celulares confiables que se puedan realizar en formatos de detección de alto rendimiento (HTS). Se cree que las proteínas no estructurales (NS) del flavivirus se ensamblan co-traslacionalmente en las membranas del retículo endoplásmico (ER), formando el complejo de replicación (RC). El NS3 y el NS5 son las enzimas más estudiadas del RC y constituyen los principales objetivos para el desarrollo de fármacos debido a sus funciones cruciales en la replicación del genoma viral. El dominio de la proteasa NS3, que requiere NS2B como cofactor, es responsable de la escisión de la poliproteína viral inmadura en las proteínas NS maduras, mientras que el dominio NS5 RdRp es responsable de la replicación del ARN. A continuación, describimos en detalle los protocolos utilizados en los exámenes basados en replicon y los ensayos enzimáticos para probar grandes bibliotecas de compuestos para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika (ZIKV). Los replicones son sistemas subgenómicos autorreplicantes expresados en células de mamíferos, en los que los genes estructurales virales son reemplazados por un gen reportero. Los efectos inhibitorios de los compuestos sobre la replicación del ARN viral se pueden evaluar fácilmente midiendo la reducción de la actividad de la proteína reportera. Los exámenes basados en replicon se realizaron utilizando una línea celular de replicon BHK-21 ZIKV que expresa renilla luciferasa como gen reportero. Para caracterizar los objetivos específicos de los compuestos identificados, establecimos ensayos in vitro basados en fluorescencia para la proteasa NS3 expresada recombinantemente y NS5 RdRp. La actividad proteolítica de la proteasa viral se midió utilizando el sustrato peptídico fluorogénico Bz-nKRR-AMC, mientras que la actividad de elongación NS5 RdRp se detectó directamente por el aumento de la señal fluorescente de SYBR Green I durante el alargamiento del ARN, utilizando la plantilla sintética de autocebado biotinilado 3′UTR-U30 (5′-biotina-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′).
Introduction
El virus Zika (ZIKV) es un virus emergente transmitido por artrópodos miembro del género Flavivirus,que incluye el virus del dengue (DENV), el virus de la encefalitis japonesa (JEV) y el virus de la fiebre amarilla (YFV), que representan amenazas constantes para la salud pública1. El brote de ZIKV 2015-16 en las Américas recibió atención mundial después de su aparición en Brasil debido a la asociación con trastornos neurológicos graves, como la microcefalia congénita asociada a ZIKV en recién nacidos2,3 y el síndrome de Guillain-Barré en adultos4. Aunque el número de casos de infección disminuyó a lo largo de los próximos dos años, las transmisiones autóctonas de ZIKV transmitidas por mosquitos se verificaron en 87 países y territorios en 2019, lo que evidencia el potencial del virus para resurgir como una epidemia5. Hasta la fecha, no hay vacunas aprobadas o medicamentos efectivos contra la infección por ZIKV.
El descubrimiento de fármacos antivirales requiere el desarrollo de ensayos celulares y bioquímicos confiables que se puedan realizar en formatos de detección de alto rendimiento (HTS). Los exámenes basados en replicon y los ensayos basados en enzimas virales son dos estrategias valiosas para probar compuestos de moléculas pequeñas para inhibidores de ZIKV1. Se cree que las proteínas no estructurales (NS) del flavivirus se ensamblan cotraducciónlmente en las membranas del retículo endoplásmico (RE), formando el complejo de replicación (RC)6. El NS3 y el NS5 son las enzimas más estudiadas del RC y constituyen los principales objetivos para el desarrollo de fármacos debido a sus funciones cruciales en la replicación del genoma viral. El dominio de la proteasa NS3, que requiere NS2B como cofactor, es responsable de la escisión de la poliproteína viral inmadura en las proteínas NS maduras, mientras que el dominio NS5 RdRp es responsable de la replicación del ARN6.
Los replicones son sistemas subgenómicos autorreplicantes expresados en células de mamíferos, en los que los genes estructurales virales son reemplazados por un gen reportero. Los efectos inhibitorios de los compuestos sobre la replicación del ARN viral pueden evaluarse fácilmente midiendo la reducción de la actividad de la proteínareportera 7. A continuación, describimos los protocolos utilizados para el cribado de inhibidores de la replicación ziKV en un formato de placa de 96 pozos. Los ensayos basados en replicon se realizaron utilizando una línea celular BHK-21 ZIKV Rluc replicon que hemos desarrollado recientemente8. Para caracterizar los objetivos específicos de los compuestos identificados, establecimos ensayos in vitro basados en fluorescencia para la proteasa NS3 expresada recombinantemente utilizando el sustrato peptídico fluorogénico, Bz-nKRR-AMC, mientras que para NS5 RdRp medimos el alargamiento de la plantilla de autocebado biotinilado sintético 3′UTR-U30 (5′-biotina-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′), utilizando el colorante intercalante SYBR Green I.
La proteasa ZIKV (45-96 residuos del cofactor NS2B unidos a los residuos 1-177 del dominio proteasa NS3 por un enlazador rico en glicina [G4SG4])se obtuvo, según se describe para YFV9,mientras que la polimerasa (276-898 residuos del dominio RdRp) se clonó y expresó, como se detalla en10. Ambas secuencias enzimáticas se derivaron de GenBank ALU33341.1. Como exámenes antivirales primarios, los compuestos se prueban a 10 μM y los que muestran actividades ≥ 80% se evalúan de manera dependiente de la dosis, lo que resulta en las concentraciones efectivas / inhibición (EC50 o IC50) y citotóxicas (CC50). En el contexto de resultados representativos, se muestran los valores EC50 y CC50 de NITD008, un inhibidor conocido de flavivirus11,a partir de cribados basados en replicon. Para los ensayos enzimáticos, se muestran los valores de IC50 de dos compuestos de la Caja de Respuesta Pandémica MMV/DNDi, una biblioteca compuesta por 400 moléculas con actividades antibacterianas, antifúngicas y antivirales. Los protocolos descritos en este trabajo podrían modificarse para detectar inhibidores de otros flavivirus relacionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos descritos en este documento podrían adaptarse fácilmente para las pruebas de detección en formatos de 384 o 1536 pozos. Para los cribados bioquímicos y/o celulares realizados en formato HTS, el valor del factor Z’, un parámetro estadístico, se calcula para cada placa para garantizar la sensibilidad, reproducibilidad y precisión de esos ensayos12. Se espera un valor del factor Z’ de 0,5 o superior para los cribado basados en replicon, mientras que se espera un valor de 0,7 o s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), la subvención CEPID 2013/07600-3 a GO, la subvención 2018/05130-3 a RSF y 2016/19712-9 a ASG, y la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (subvención 88887.516153/2020-00) a ASG. Nos gustaría agradecer a Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) y a la iniciativa Drugs for Neglected Diseases (DNDi, www.dndi.org) por su apoyo, diseño de la Caja de Respuesta a la Pandemia y suministro de los compuestos.
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
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