मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से 3 डी रेटिना ऊतकों के व्युत्पन्न के लिए रेटिना ऑर्गेनॉइड इंडक्शन सिस्टम
Summary
यहां हम एक अनुकूलित रेटिना ऑर्गेनॉइड इंडक्शन सिस्टम का वर्णन करते हैं, जो उच्च प्रजनन क्षमता और दक्षता के साथ रेटिना ऊतक उत्पन्न करने के लिए विभिन्न मानव बहुलता स्टेम सेल लाइनों के लिए उपयुक्त है।
Abstract
रेटिना अपक्षयी रोग प्रभावी उपचार के बिना अपरिवर्तनीय अंधापन के मुख्य कारण हैं। Pluripotent स्टेम सेल है कि रेटिना कोशिकाओं के सभी प्रकार में अंतर करने की क्षमता है, यहां तक कि मिनी रेटिना ऊतकों, इन रोगों और रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग में कई अवसरों के साथ रोगियों के लिए भारी वादों पकड़ो । हालांकि, एचपीएससी से रेटिना कोशिकाओं में शामिल करने की प्रक्रिया जटिल और समय लेने वाली है। यहां, हम उच्च प्रजनन क्षमता और दक्षता के साथ रेटिना ऊतक उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित रेटिना प्रेरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो विभिन्न मानव बहुलता स्टेम कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है। यह प्रोटोकॉल रेटिनोइक एसिड के अलावा किया जाता है, जो शंकु फोटोरिसेप्टर्स के संवर्धन को लाभ पहुंचाता है। इस प्रोटोकॉल का लाभ रेटिना प्रेरण की दक्षता और पुनरावृत्ति को बढ़ाने के लिए ईबी आकार और चढ़ाना घनत्व का मात्राकरण है। इस विधि के साथ, सभी प्रमुख रेटिना कोशिकाएं क्रमिक रूप से दिखाई देती हैं और रेटिना विकास के मुख्य चरणों को पुन: रीकैपिटल करती हैं। इसमें डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस जैसे डिजीज मॉडलिंग और सेल थेरेपी की सुविधा होगी ।
Introduction
रेटिना अपक्षयी रोग (आरडीएस), जैसे उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी) और रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी), फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की शिथिलता और मृत्यु की विशेषता है और आम तौर पर1को ठीक करने के प्रभावी तरीकों के बिना अपरिवर्तनीय दृष्टि हानि का कारण बनता है। इन रोगों में अंतर्निहित तंत्र मानव रोग मॉडल2की कमी के कारण आंशिक रूप से अज्ञात है । पिछले दशकों में, स्टेम सेल प्रौद्योगिकी के माध्यम से पुनर्योजी चिकित्सा में महत्वपूर्ण प्रगति को पूरा किया गया है । अपने आप सहित कई शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) सहित मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs), रेटिना कोशिकाओं के सभी प्रकार में अंतर कर सकते हैं, यहां तक कि विभिन्न भेदभाव दृष्टिकोण के माध्यम से मिनी रेटिना ऊतक3,4,5,6,7,8,9,10, 11, रोग मॉडलिंग और सेल थेरेपी में अपार संभावनाएं प्रदान करना12,13,14.
हालांकि, एचपीएससी से रेटिना कोशिकाओं में प्रेरण प्रक्रिया अत्यधिक जटिल और कम पुनरावृत्ति के साथ समय लेने वाली है, जिसके लिए शोधकर्ताओं को समृद्ध अनुभव और उच्च कौशल की आवश्यकता होती है । जटिल और गतिशील प्रेरण प्रक्रिया के दौरान, कई कारक रेटिना ऊतकों की उपजको प्रभावित करेंगे 15,16,17। इसके अलावा, रेटिना मार्कर के समय और मजबूत अभिव्यक्ति में अक्सर विभिन्न प्रेरण विधियां काफी भिन्न होती हैं, जो नमूना संग्रह और डेटा व्याख्या3को चकित कर सकती हैं। इसलिए, कदम-दर-कदम मार्गदर्शन के साथ एचपीएससी से रेटिना भेदभाव का एक सीधा प्रोटोकॉल मांग में होगा ।
यहां, हमारे प्रकाशित अध्ययनों के आधार पर18,19,20,21,एचपीएससी से समृद्ध शंकु फोटोरिसेप्टर के साथ रेटिना ऑर्गेनॉइड (आरओ) उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित रेटिना प्रेरण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जिसके लिए रेटिनोइक एसिड (आरए) के पूरक की आवश्यकता नहीं है। यह प्रोटोकॉल तंत्रिका रेटिना और आरपीई उत्पन्न करने के लिए बहु-चरण विधि के विवरण पर केंद्रित है। ईबी गठन प्रारंभिक प्रेरण चरण का अनिवार्य हिस्सा है। ईबी के आकार और चढ़ाना घनत्व दोनों मात्रात्मक रूप से अनुकूलित होते हैं, जो वैज्ञानिक रूप से रेटिना ऊतकों की उपज को बढ़ाता है और पुनरावृत्ति को बढ़ावा देता है। प्रेरण के दूसरे भाग में, ऑप्टिक वेसिकल्स (ओवी) निलंबन संस्कृति में पालन संस्कृति और आरओ रूप में स्वयं व्यवस्थित करते हैं; इस भाग के समय पाठ्यक्रम और क्षमता विभिन्न एचपीपीएससी लाइनों में काफी भिन्न होती है। आरओ में रेटिना कोशिकाओं की परिपक्वता और विनिर्देश मुख्य रूप से प्रेरण के मध्य और देर चरण में होते हैं। आरए के अलावा, अमीर शंकु और छड़ दोनों के साथ परिपक्व फोटोरिसेप्टर का उत्पादन किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अनुभवहीन शोधकर्ताओं को दोहराने के लिए प्रत्येक कदम का मात्रात्मक रूप से वर्णन और विस्तार करना है। विभिन्न एचपीएससी लाइनों को इस प्रोटोकॉल द्वारा सफलतापूर्वक आरओ में प्रेरित किया गया है जिसमें शंकु से भरपूर रेटिना ऊतकों की मजबूत उपज और उच्च पुनरावृत्ति क्षमता है। इस प्रोटोकॉल के साथ एचपीएससी-व्युत्पन्न आरओ वीवो मेंरेटिना विकास के मुख्य चरणों को फिर से पुनर्पूंजीकरण कर सकते हैं, और दीर्घकालिक जीवित रह सकते हैं, जो रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और सेल थेरेपी जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस बहु-कदम रेटिना प्रेरण प्रोटोकॉल में, एचपीएससी को रेटिना भाग्य हासिल करने के लिए कदम से कदम पर निर्देशित किया गया था, और टुकड़े टुकड़े में भरे एनआर और आरपीई युक्त रेटिना ऑर्गेनॉइड में स्वयं-संगठित कि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFC11011103, 2017YFA010101), ग्वांग्झू विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना कोष (201803010078), गुआंगदोंग प्रांत की विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (2017B02020230003), चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NSF) द्वारा समर्थित किया गया था ( 81570874, 81970842), सन यात-सेन विश्वविद्यालय (PT1001010) के सौ प्रतिभा कार्यक्रम, और नेत्र विज्ञान के राज्य कुंजी प्रयोगशाला के मौलिक अनुसंधान कोष ।
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
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