نظام تحريض الشبكية Organoid لاستخلاص أنسجة الشبكية ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Summary
هنا نحن نصف نظام التعريفي الجهازي الشبكية الأمثل، والتي هي مناسبة لمختلف خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لتوليد أنسجة الشبكية مع استنساخ عالية والكفاءة.
Abstract
أمراض الشبكية التنكسية هي الأسباب الرئيسية للعمى لا رجعة فيه دون علاج فعال. الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي لديها القدرة على التفريق في جميع أنواع خلايا الشبكية، حتى أنسجة الشبكية المصغرة، تحمل وعودا ضخمة للمرضى الذين يعانون من هذه الأمراض والعديد من الفرص في نمذجة الأمراض وفحص الأدوية. ومع ذلك، فإن عملية الحث من hPSCs إلى خلايا الشبكية معقدة وتستغرق وقتا طويلا. هنا، نقوم بوصف بروتوكول تحريض شبكية العين الأمثل لتوليد أنسجة الشبكية مع إعادة إنتاج عالية والكفاءة، ومناسبة لمختلف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. يتم تنفيذ هذا البروتوكول دون إضافة حمض الريتينويك ، والذي يفيد إثراء مستقبلات ضوئية مخروطية. ميزة هذا البروتوكول هو تحديد حجم EB وكثافة الطلاء لتعزيز كفاءة وتكرار تحريض الشبكية بشكل كبير. مع هذه الطريقة، تظهر جميع خلايا الشبكية الرئيسية بشكل تسلسلي وتلخص الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية. وسوف يسهل تطبيقات المصب، مثل نمذجة الأمراض والعلاج بالخلايا.
Introduction
تتميز الأمراض التنكسية الشبكية (RDs) ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) والتهاب الشبكية الصباغي (RP) ، بضعف ووفاة خلايا المستقبل الضوئي وتؤدي عادة إلى فقدان البصر الذي لا رجعة فيه دون طرق فعالة لعلاج1. الآلية الكامنة وراء هذه الأمراض غير معروفة إلى حد كبير ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود نماذج الأمراض البشرية2. على مدى العقود الماضية، تم تحقيق تقدم كبير في الطب التجديدي من خلال تكنولوجيا الخلايا الجذعية. وقد أظهرت العديد من الباحثين، بما في ذلك أنفسنا، أن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSCs)، يمكن أن تفرق في جميع أنواع خلايا الشبكية، حتى الأنسجة الشبكية المصغرة من خلال نهج التمايز المختلفة3،4،5،6،7،8،9،10، 11, توفير إمكانات هائلة في نمذجة المرض والعلاج الخلوي12,13,14.
ومع ذلك ، فإن عملية التعريفي من hPSCs إلى خلايا الشبكية معقدة للغاية وتستغرق وقتا طويلا مع تكرار منخفض ، مما يتطلب باحثين ذوي خبرة غنية ومهارات عالية. خلال عملية التعريفي المعقدة والديناميكية ، سيؤثر عدد من العوامل على غلة أنسجة الشبكية15،16،17. أيضا، تختلف أساليب التعريف المختلفة في كثير من الأحيان اختلافا كبيرا في التوقيت والتعبير القوي عن علامات الشبكية، والتي قد تربك جمع العينات وتفسير البيانات3. ولذلك، سيكون هناك طلب على بروتوكول مباشر لتمايز الشبكية عن مركبات الكربون الهيدروفلورية مع توجيه خطوة بخطوة.
هنا، استنادا إلى دراساتنا المنشورة18،19،20،21، يتم وصف بروتوكول تحريض الشبكية الأمثل لتوليد أعضاء الشبكية (ROs) مع مستقبلات ضوئية مخروطية غنية من hPSCs ، والتي لا تتطلب تكملة حمض الريتينويك (RA). يركز هذا البروتوكول على وصف الأسلوب متعدد الخطوات لتوليد الشبكية العصبية وRPE. تشكيل EB هو الجزء الأساسي من مرحلة التعريفي المبكر. يتم تحسين كل من حجم وكثافة الطلاء من EBs كميا، مما يعزز علميا غلة أنسجة الشبكية ويعزز التكرار. في الجزء الثاني من الحث ، تنظم الحويصلات البصرية (OVs) نفسها في ثقافة الالتزام وشكل ROs في ثقافة التعليق ؛ دورات الوقت والكفاءة من هذا الجزء تختلف اختلافا كبيرا في خطوط hPSC مختلفة. نضوج ومواصفات خلايا الشبكية في ROs تحدث أساسا في المرحلة الوسطى والمتأخرة من التعريفي. دون إضافة RA، يمكن إنتاج مستقبلات ضوئية ناضجة مع كل من المخاريط الغنية وقضبان.
الغرض من هذا البروتوكول هو وصف تفاصيل كل خطوة من خطوات الباحثين عديمي الخبرة لتكرارها. وقد تم حث مختلف خطوط hPSC بنجاح في ROs من خلال هذا البروتوكول مع غلة قوية من أنسجة الشبكية الغنية بالمخروط وقابلية التكرار العالية. يمكن لمنظمات المجتمع المدني المشتقة من HPSCs مع هذا البروتوكول تلخيص الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية في الجسم الحي، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل ، مما يسهل تطبيقات المصب ، مثل نمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والعلاج بالخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول التعريفي الشبكي متعدد الخطوات، تم توجيه hPSCs خطوة بخطوة للحصول على مصير الشبكية، ونظمت ذاتيا في organoids الشبكية التي تحتوي على NR مغلفة وRPE. خلال التمايز، قامت hPSCs بتلخيص جميع الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية البشرية في الجسم الحي، من EF و OV و RPE ، إلى صفح الشبكية ، مما أدى إل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFC1101103، 2017YFA0104101)، وصندوق مشروع العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (201803010078)، ومشروع العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة قوانغدونغ (2017B020230003)، ومؤسسة العلوم الطبيعية (NSF) في الصين (81570874، 81970842)، وبرنامج مائة موهبة من جامعة صن يات صن (PT1001010)، وصناديق البحوث الأساسية في المختبر الرئيسي للدولة لطب العيون.
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
- Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
- Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
- Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
- Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber’s congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
- Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
- da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
- Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
- Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
- Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
- Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
- DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).
