מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
Summary
כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.
Abstract
מחלות ניווניות ברשתית הן הגורמים העיקריים לעיוורון בלתי הפיך ללא טיפול יעיל. תאי גזע פלוריפוטנטים בעלי פוטנציאל להבדיל לכל סוגי תאי הרשתית, אפילו רקמות מיני-רשתית, מחזיקים בהבטחות עצומות לחולים במחלות אלה ובהזדמנויות רבות במודל מחלות ובהקרנת תרופות. עם זאת, תהליך האינדוקציה מ hPSCs לתאי רשתית הוא מסובך וגוזל זמן רב. כאן, אנו מתארים פרוטוקול אינדוקציה רשתית ממוטב כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה, מתאים לתאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים. פרוטוקול זה מבוצע ללא תוספת של חומצה רטינואית, אשר מועיל העשרה של קולטני חרוט. היתרון של פרוטוקול זה הוא כימות גודל EB וצפיפות ציפוי כדי לשפר באופן משמעותי את היעילות ואת יכולת החזרה של אינדוקציה רשתית. בשיטה זו, כל תאי הרשתית העיקריים מופיעים ברצף ומשיבים מחדש את השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית. זה יקל על יישומים במורד הזרם, כגון מידול מחלות וטיפול בתאים.
Introduction
מחלות ניווניות ברשתית (RDs), כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ורטיניטיס פיגמנטוזה (RP), מאופיינות בתפקוד ובמותם של תאי פוטורצפטור ובדרך כלל מובילות לאובדן ראייה בלתי הפיך ללא דרכים יעילות לרפא1. המנגנון שבביסן מחלות אלה אינו ידוע במידה רבה חלקית בשל היעדר מודלים למחלות אנושיות2. בעשורים האחרונים הושגה התקדמות משמעותית ברפואה רגנרטיבית באמצעות טכנולוגיית תאי גזע. חוקרים רבים, כולל עצמנו, הראו כי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם (hiPSCs), יכולים להבדיל לכל סוגי תאי הרשתית, אפילו רקמות מיני-רשתית באמצעות גישות שונות של בידול3,4,5,6,7,8,9,10, 11,מתן פוטנציאל עצום בדוגמנות מחלות וטיפולבתאים 12,13,14.
עם זאת, תהליך האינדוקציה מ hPSCs לתאי רשתית הוא מסובך מאוד זמן רב עם יכולת חזרה נמוכה, אשר דורש חוקרים עם ניסיון עשיר וכישורים גבוהים. במהלך תהליך האינדוקציה המורכב והדינמי, מספר גורמים ישפיעו על התשואה של רקמות הרשתית15,16,17. כמו כן, שיטות אינדוקציה שונות משתנות לעתים קרובות במידה ניכרת בתזמון ובביטוי חזק של סמני רשתית, אשר עשוי לבלבל את איסוף המדגם ואת פרשנות הנתונים3. לכן, פרוטוקול פשוט של בידול רשתית מ hPSCs עם הדרכה צעד אחר צעד יהיה ביקוש.
כאן, בהתבסס על המחקרים שפורסמו שלנו18,19,20,21, פרוטוקול אינדוקציה רשתית ממוטבת כדי ליצור organoids רשתית (ROs) עם קולטני חרוט עשירים מן hPSCs מתואר, אשר אינו דורש תוספת של חומצה רטינואית (RA). פרוטוקול זה מתמקד בתיאור השיטה הרב-שלבים ליצירת רשתית עצבית ו- RPE. היווצרות EB היא החלק החיוני של שלב האינדוקציה המוקדמת. הן גודל וצפיפות ציפוי של EBs הם אופטימיזציה כמותית, אשר מדעית משפר את התשואה של רקמות רשתית ומקדם חזרה. בחלק השני של האינדוקציה, שלטי אופטיים (OVs) מתארגנים את עצמם בתרבות הדבקות ובצורת ROs בתרבות ההשעיה; קורסי הזמן והיעילות של חלק זה משתנים במידה ניכרת בשורות hPSC שונות. ההבשלה והמפרט של תאי הרשתית ב- ROs מתרחשים בעיקר בשלב האמצעי והמאוחר של האינדוקציה. ללא תוספת של RA, קולטני פוטו בוגרים עם קונוסים ומוטות עשירים יכולים להיות מיוצרים.
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר ולפרט כמותית כל שלב שחוקרים חסרי ניסיון יחזרו על עצמם. קווי hPSC שונים הושרו בהצלחה לתוך ROs על ידי פרוטוקול זה עם תשואה חזקה של רקמות רשתית עשירות חרוט ויכולת חזרה גבוהה. ROs שמקורם ב- HPSCs עם פרוטוקול זה יכולים לשחזר את השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית ב- vivo, ולשרוד לטווח ארוך, המאפשר יישומים במורד הזרם, כגון מידול מחלות, הקרנת תרופות וטיפול בתאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול אינדוקציה רב-שלבי רשתית זה, hPSCs הונחו צעד אחר צעד כדי להשיג את גורל הרשתית, וארגנו את עצמם לאורגנואידים ברשתית המכילים NR למינציה ו- RPE. במהלך ההבחנה, hPSCs recapitulated כל השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית האנושית vivo, מ EF, OV, ו- RPE, כדי למינציה ברשתית, יצירת כל תת סוגים של תאים רשתית, כולל …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), קרן פרויקט המדע והטכנולוגיה של גואנגג’ואו (201803010078), פרויקט המדע והטכנולוגיה של מחוז גואנגדונג (2017B020230003), הקרן למדעי הטבע (NSF) של סין (81570874, 81970842), מאה כישרונות של אוניברסיטת סון יאט-סן (PT1001010), וקרנות המחקר הבסיסיות של מעבדת מפתח המדינה של רפואת עיניים.
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
- Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
- Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
- Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
- Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber’s congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
- Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
- da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
- Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
- Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
- Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
- Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
- DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).
