Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

إنتاج بروتينات PRMT المؤتلفة باستخدام نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو

Published: July 17, 2021 doi: 10.3791/62510
Automatic Translation
1, 1
1Structural Genomics Consortium, University of Toronto

Summary

نظام ناقلات التعبير عن الفيروسات الكولوئية (BEVS) هو منصة قوية لفحص التعبير وإنتاج البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراس (PRMTs) لاستخدامها في الدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والهيكلية. يمكن إنتاج كميات ملليغرام من المواد لغالبية PRMTs والبروتينات الأخرى ذات الأهمية التي تتطلب منصة التعبير eukaryotic.

Abstract

البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراسيس (PRMTs) بقايا الميثيلات أرجينين على مجموعة واسعة من البروتينات التي تلعب أدوارا في العديد من العمليات الخلوية. PRMTs يمكن إما أحادية أو ثنائي ميثيلات مجموعات أرجينين جوانيدينو بشكل متناظر أو غير متماثل. الأنزيمولوجيا من هذه البروتينات هي منطقة معقدة والتحقيق المكثف الذي يتطلب كميات ملليغرام من البروتين المؤتلف عالية الجودة. تم استخدام نظام متجهات التعبير عن الفيروسات الكولوبية (BEVS) الذي يستخدم Autographa californica متعددة nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) وSpodoptera frugiperda 9 (Sf9) خلايا الحشرات لفحص التعبير وإنتاج العديد من PRMTs ، بما في ذلك PRMT 1 و 2 و 4 إلى 9. في وقت واحد للشاشة للتعبير عن بنيات متعددة من هذه البروتينات، بما في ذلك المجالات وشظايا مبتورة، فضلا عن البروتينات كاملة الطول، قمنا بتطبيق أساليب قابلة للتطوير باستخدام ماصة متعددة القنوات قابلة للتعديل وبرمجة، جنبا إلى جنب مع لوحات 24-و 96-well وكتل. وعموما، مكنت هذه التعديلات طريقة توليد واسعة النطاق من الحمض النووي bacmid، والفيروسات المؤتلفة، وفحص التعبير البروتين. ساعد استخدام الأوعية الثقافية ذات الحجم العالي من تعليق خلايا Sf9 على التغلب على قيود المساحة في خط أنابيب الإنتاج لإنتاج البروتين على نطاق واسع دفعة واحدة. هنا، نقوم بوصف البروتوكولات التفصيلية للتعبير الفعال والفعال من حيث التكلفة عن PRMTs الوظيفية للدراسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية والهيكلية.

Introduction

البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراسيس (PRMTs) ميثيلات أرجينين المخلفات بطريقة أحادية ميثيل أو متماثل / ثنائي ميثيل غير متماثل. وتفضل كثيرا تسلسل RG/RGG/GRG المتكررة من قبل معظم PRMTs وتوجد في مجموعة واسعة من البروتينات1،2. البروتينات الميثيلية أرجينين مثل الهستونات أو عوامل النسخ وعوامل الربط تنظيم النسخ, الربط, وهيكل الكروماتين3,4. زيادة المعرفة بتنظيم متنوع من الركيزة واستخدام عامل مساعد، دوران، وحركية PRMTs، فضلا عن توليد مثبطات انتقائية، وقد ألقى الضوء الميكانيكي على هذه الإنزيمات ومجمعاتها5،6. ومع ذلك، لا تتم دراسة جميع أفراد أسرة PRMT بنفس القدر؛ على سبيل المثال، تم اكتشاف PRMT9 مؤخرا فقط ليكون عضوا في عائلة PRMT1. تتطلب دراسات وظيفة الهيكل والانزيم لهذه البروتينات كميات كافية ، غالبا ما تكون ملليغرام ، من البروتين المؤتلف لتكون متاحة.

الإشريكية القولونية (E. coli) نظام التعبير prokaryotic عادة ما يكون الخيار الأول لفحص التعبير باستخدام بنيات متعددة لبروتين معين7,8,9. ومع ذلك ، فإن التعبير القائم على الإشريكية القولونيةلا يؤدي دائما إلى كميات كافية من بروتينات PRMT في أشكالها النشطة ، كما لاحظنا بشكل خاص بالنسبة ل PRMT5 و PRMT7 (انظر أدناه). وهكذا، فإن تكنولوجيات PRMTs التي لم تعبر عن الإشريكية القولونية أو التي تحتاج إلى إنتاجها بواسطة آلية التعبير eukaryotic كانت معلبة في ناقلات مناسبة لفحص التعبير في نظام متجه التعبير البديل لفيروس الباكولو (BEVS). في حين أعرب E. coli عينات من PRMT1، PRMT3 وPRMT8 وقد استخدمت على نطاق واسع في المقايسات المختبرية والبلورات، PRMTs أخرى مثل PRMT5، الذي يتطلب MEP50 شريك ملزم من مجالها ميثيل ترانسفيراز المزدوج، وPRMTs مثل PRMT7 و 9، تتطلب التعبير عن خلايا الحشرات للحصول على كميات كافية من البروتين النشط. بشكل عام ، استخدمت المقايسات الموحدة متوسطة الإنتاجية ميثيل ترانسفيراز ل PRMT4 و 5 و 6 و 7 و 9 BEVS في خلايا الحشرات6. نظام متجهات التعبير عن الفيروسات الكولولية (BEVS) هو منصة متعددة الاستخدامات لإنتاج البروتينات المؤتلفة التي تتطلب آلات التعبير eukaryotic التي تمكن من التعديلات ما بعد الترجمة الضرورية للدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والهيكلية10،11،12. أصبحت العديد من BEVSs متاحة تجاريا منذ أول استخدام للفيروسات الكولوفيروس في عام 1983 للتعبير عن البروتين13. تستخدم معظم هذه البروتوكولات استراتيجيات مختلفة لنقل البلازميد التعبيري إلى خلايا الحشرات. وتشمل هذه باك إلى باك، flashBAC، BaculoGOLD مشرق، BacVector-3000، BacMagic، BacPAK، الخ. ويستند بروتوكولنا على النظام الأكثر استخداما في BEVS، ونظام البكالوريا إلى البكالوريا14،الذي يهدف إلى نقل الجين / cDNA ترميز البروتين من الفائدة (POI، هنا PRMTs) في الجينوم فيروس baculo الحفاظ عليها في سلالة متخصصة من القولونية E. عن طريق نقل موقع محدد15.

لفترة وجيزة، تم تحويل ناقل نقل البلازميد الذي يحتوي على جين الفائدة إلى خلايا DH10Bac E. coli المختصة لتوليد الحمض النووي الفيروسي bacmid المؤتلف. ثم تم نقل خلايا Sf9 الملتصقة بالحمض النووي الباكميد. بعد أربعة إلى خمسة أيام من العدوى، تم استرداد الفيروسات الباكولوية المؤتلفة الأولية التي تفرز في وسط زراعة الخلايا ووصفت بأنها فيروس P1. ثم استخدمت مخزونات فيروس الباكولو P1 لتضخيم الفيروسات (أي توليد مخزونات فيروسات الباكولو P2) وفحص التعبير عن البروتين. استنادا إلى نتائج فحص التعبير ، تم تحديد فيروسات P2 للحصول على أفضل تعبير عن البروتين واستخدامها لتوليد ثقافات تعليق خلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو (SCBIIS) لإنتاج البروتين على نطاق واسع. هنا، نقوم بوصف بروتوكولاتنا التفصيلية ووصف الأساس المنطقي وراء اختياراتنا للكواشف والثقافة لدعم استراتيجيتنا لتطوير منهجية أكثر كفاءة من حيث الوقت، وفعالة من حيث التكلفة، وقابلة للتوسع للحصول على كميات كافية من البروتينات المؤتلفة المطلوبة.

Protocol

ملاحظة: يتم تحديد نظرة عامة حول خطوات بروتوكول BEVS في الشكل 1.

1. جيل من الحمض النووي bacmid المؤتلف

  1. إعداد لوحات LB أجار انتقائية لتحويل DH10Bac
    1. إعداد لوحات أجار LB التي تحتوي على: 50 ميكروغرام / مل كاناميسين، 7 ميكروغرام / مل جنتاميسين، 10 ميكروغرام / مل رباعي السيكلين، 200 ميكروغرام / مل بلو غال، و 40 ميكروغرام / مل IPTG لتحديد لDH10Bac المحولات.
    2. تزن 25 غرام من مرق LB premixed و 13 غرام من أغار باكو ووضعها في قارورة 2 L. رفع مستوى الصوت إلى 1 لتر مع الماء المقطر وautoclave لمدة 15-30 دقيقة في 121 درجة مئوية.
    3. تعيين حمام مائي في 50 درجة مئوية وتبريد الحل أجار autoclaved في حمام الماء لمدة 40-60 دقيقة حتى يتم تبريده إلى 50-55 درجة مئوية.
    4. إلى محلول تبريد, إضافة جنتاميسين إلى تركيز النهائي من 7 ميكروغرام / مل, kanamycin إلى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل, التتراسيكلين إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل, بلو غال إلى تركيز نهائي من 200 ميكروغرام / مل, و IPTG إلى تركيز نهائي من 40 ميكروغرام / مل.
    5. مزيج الحل أجار وaliquot 7-10 مل من المتوسطة إلى كل لوحة 60 ملم باستخدام ماصة 50 مل. دع الأطباق تجلس في درجة حرارة الغرفة (2 ساعة) لتصلب. عكس، التفاف وتخزينها في 4 °C. الأطباق التي تحتوي على المضادات الحيوية مستقرة لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  2. تحويل البلازميد إلى خلايا DH10Bac E. القولونية المختصة
    1. حساب الحجم المطلوب من الخلايا المختصة.
    2. تذوب الخلايا المختصة على الجليد، تدور بلطف إلى أسفل وإعادة الإنفاق مرة أخرى عن طريق التنصت لطيف.
    3. استخدام ماصة 12 قناة للاستغناء عن 4 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من لوحة PCR 96 جيدا.
    4. إضافة ~ 0.3-0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد المؤتلف إلى الخلايا المختصة وتخلط بلطف عن طريق التنصت. احتضان الخليط على الجليد لمدة 10-15 دقيقة.
    5. الحرارة صدمة الخليط في جهاز PCR في 42 درجة مئوية لمدة 45 s. يبرد على الثلج لمدة دقيقتين.
    6. الاستغناء عن 0.5 مل من SOC المتوسطة إلى كل بئر من كتل 96 بئر (96 عميق جيدا 2.4 مل).
    7. استخدم ماصة من 12 قناة لنقل التعليق البكتيري المحول إلى البئر المقابل للكتلة وتغطيته بورقة بار.
    8. ضع الكتلة في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية مع هياج متوسط (205 دورة في الدقيقة) لمدة 4-5 ساعة.
    9. انتشار بالتساوي 30-50 ميكرولتر من الثقافة على سطح لوحة أجار LB باستخدام الخرز الزجاج العقيم. تخزين بقية الثقافة في 4 °C .
    10. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية حتى لون المستعمرات الزرقاء / البيضاء هو ملحوظ (40-48 ساعة). تجاهل الثقافة عندما يتم الحصول على ما يكفي من الأبيض، مستعمرات كبيرة على لوحة.
    11. لضمان أن المستعمرات البيضاء تحتوي فقط على الحمض النووي bacmid المؤتلف، إعادة خط مستعمرة واحدة بيضاء معزولة على لوحات أجار LB الطازجة التي تحتوي على المضادات الحيوية، بلو غال، وINPTG للتحقق من النمط الظاهري.
    12. حضانة لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية.
    13. اختيار مستعمرة واحدة بيضاء التحقق من لوحة إعادة streaked لاستخراج الحمض النووي bacmid المؤتلف.
  3. عزل الحمض النووي bacmid المؤتلف
    1. تلقيح مستعمرة بيضاء واحدة معزولة إلى 3 مل من LB المتوسطة تكملها 50 ميكروغرام / مل kanamycin، 7 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين في كتل 24 جيدا (24 جيدا كتل القاع الجولة) وتغطية مع ورقة airpore.
    2. تنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة.
    3. الطرد المركزي كتل 24 بئرا في 2100 × غرام لمدة 10 دقائق. decant supernatant، عكس الكتلة، والاستفادة بلطف على ورقة الأنسجة الماصة. إضافة 250 ميكرولتر من الحل 1 (حل إعادة البقاء الخلية) إلى كل بئر.
    4. ختم كتل مع منصات الشريط أو أي أفلام الختم الأخرى ووضعها على منصة تهتز في 75 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقيقة. تحقق من كل بئر لضمان تحلل الخلايا المناسب، وإعادة الإنفاق إذا لزم الأمر، باستخدام طرف 1 مل.
    5. إضافة 250 ميكرولتر من الحل 2 (حل تحلل الخلية) إلى كل بئر، وختم الكتل، ووضعها على منصة اهتزاز في 75 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (لتجنب التلوث المتبادل للعينات، لا عكس كتل 24 بئر) احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
    6. أضف 250 ميكرولتر من الحل 3 (حل الإبطال)، واغلق الكتل، وضع على منصة الاهتزاز عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. وسوف تتشكل عجلة بيضاء سميكة من البروتين والحمض النووي الجينومي الإشريكية القولونية. ضع العينة على الجليد لمدة 10-15 دقيقة.
    7. الطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في 2100 × ز في 4 درجة مئوية لبيليه بإحكام المواد ترسب الأبيض. أثناء الطرد المركزي، قم بتسمية أنبوب طرد مركزي جديد وأضف 0.8 مل من الإيزوبروبانول المطلق.
    8. نقل بلطف supernatant إلى أنبوب يحتوي على ايزوبروبانول، وتجنب أي مادة ترسب الأبيض. تخلط عن طريق عكس بلطف أنبوب عدة مرات ومن ثم وضعها على الجليد لمدة 5 إلى 10 دقائق. في هذه المرحلة، يمكن تخزين العينة عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    9. طرد مركزي العينة لمدة 15 دقيقة في 14000 س غ في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant وإضافة 0.5 مل من الإيثانول 70٪ إلى كل أنبوب. عكس الأنبوب عدة مرات لغسل بيليه. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 14000 × غرام في درجة حرارة الغرفة. (اختياري: تكرار غسل)
    10. جلب عينات داخل غطاء محرك السيارة تدفق صفح لضمان عقم إعداد البلازميد وإزالة أكبر قدر ممكن من supernatant.
      ملاحظة: قد تصبح بيليه طرد من الجزء السفلي من الأنبوب، لذلك بعناية مشاهدة بيليه عند التخلص من supernatant.
    11. الهواء الجاف بيليه داخل غطاء محرك السيارة تدفق صفح لمدة 15 -20 دقيقة وحل الحمض النووي في 50 ميكرولتر من العازلة elution المصفاة، 10 MM تريس-Cl، درجة الحموضة 8.5 (تأكد من أن الكريات ليست أكثر من المجففة).
    12. منذ الحمض النووي bacmid المؤتلف هو أكبر من 135 كيلوبايت في الحجم، لتجنب القص من الحمض النووي، حل بيليه عن طريق التنصت لطيف.
    13. للتحقق من وجود جين الاهتمام في الحمض النووي bacmid ، قم بإعداد مزيج تفاعل PCR في لوحة PCR 96 جيدا.
    14. إعداد مزيج PCR على النحو التالي: 1 ميكرولتر من العازلة، 0.2 ميكرولتر (10 م لكل منهما) من dNTPs، 0.1 ميكرولتر من Taq DNA بوليمراز، 0.1 ميكرولتر (25 ميكرومتر) من التمهيديات الأمامية والعكسية (BACV2FWD: tattccggattattcataccg؛ BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc)، 1 ميكرولتر من الحمض النووي bacmid و 8 ميكرولتر من الماء.
    15. إجراء تضخيم للجينات المستهدفة مع التشبع الأولي لمدة 2 دقيقة عند 95 درجة مئوية، تليها 25 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة/كيلوبايت.
    16. إنهاء رد الفعل بعد التمديد النهائي لمدة 7 دقائق عند 72 درجة مئوية.
    17. تحليل 10 ميكرولتر من المنتج تضخيم على 1٪ (ث / v) هلام الآغاروز التي تحتوي على محلول تلطيخ الحمض النووي عن طريق الكهربائي.
    18. تخزين الشهادات التي تم التحقق منها في 4 °C.

2. جيل من مخزونات الفيروسات الباكولو المؤتلفة

ملاحظة: استخدم خلايا Sf9 المتنامية بشكل كبير مع قابلية البقاء بنسبة 95٪ أو أكثر لأي خطوة من بروتوكول التعبير عن الفيروسات الكولو، بما في ذلك عدوى الخلايا لتوليد الفيروسات الكولوية، وتضخيم حجم الفيروسات الكولوية، وفحص التعبير عن البروتين، وإنتاج البروتين.

  1. نقل خلايا Sf9 مع الحمض النووي Bacmid وشفافات العدوى (T.R.) مثل JetPrime أو X-tremeGENE 9.
    ملاحظة: يمكن استخدام تلطيخ الأزرق تريبان ومقياس الدم لتحديد عدد الخلايا قابلة للحياة و ٪ صلاحية الخلية. الخلايا غير قابلة للحياة تناول وصمة عار وتظهر زرقاء تحت المجهر في حين تبقى الخلايا قابلة للحياة غير ملطخة. لحساب ٪ صلاحية الخلية، يتم الحصول على إجمالي عدد الخلايا (غير ملطخ وملطخ) ويتم تقسيم عدد الخلايا القابلة للتطبيق حسب إجمالي عدد الخلايا وضربه في 100.
    1. تمييع خلايا Sf9 المتنامية بشكل كبير إلى كثافة خلايا نهائية من 4 × 105 خلايا / مل في وسائط الحشرات الخالية من المصل وتصب في خزان الكاشف العقيم.
    2. استخدام ماصة متعددة القنوات للبرمجة لزرع 0.5 مل من خلايا Sf9 المخففة في كل بئر من لوحة 24 جيدا.
    3. قم بتسمية بئر واحد من اللوحة كعنصر تحكم (غير مصاب) واستخدمه كتحكم لمقارنة الخلايا المصابة وغير المصابة لتقييم العلامات المحتملة للعدوى.
    4. بعد بذر الخلايا في لوحات، صخرة بلطف لوحات ذهابا وإيابا عدة مرات لضمان طبقة واحدة حتى من الخلايا. لا تدور لوحات لأن الخلايا سوف تتجمع في وسط البئر.
    5. احتضان لوحات في 27 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل للسماح للتعلق الخلية إلى لوحات الثقافة.
    6. تخلط جيدا قارورة كاشف العدوى. لكل إصابة، أضف 2 ميكرولتر من كاشف العدوى إلى 100 ميكرولتر من العازلة للإصابة. يمكن أيضا استخدام أي وسيط حشري آخر غير مرن. إيداع كاشف العدوى المخفف في خزان كاشف معقم ويخلط بلطف لمدة 10 ق.
    7. باستخدام ماصة من 12 قناة، نقل 102 ميكرولتر من كاشف العدوى المخفف إلى لوحة معقمة 96 ميكروويل.
    8. نقل 10 ميكرولتر من محلول 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر من الحمض النووي bacmid المؤتلف في البئر المقابلة من لوحة ميكروويل 96 جيدا ومزيج عن طريق هز بلطف (التنصت) لوحة من الجانبين.
    9. احتضان خليط العدوى لمدة 15-20 دقيقة لتمكين تشكيل معقدة.
    10. باستخدام ماصة قابلة للتعديل من 6 قنوات مصممة لنقل ما بين 96- و 24-الآبار لوحات, إضافة مزيج transfection على الخلايا دروبوايز في الآبار المقابلة من لوحات العدوى واحتضان لمدة 4-5 ساعة في 27 درجة مئوية.
    11. يهز بلطف لوحات ذهابا وإيابا عدة مرات خلال فترة الحضانة لضمان التوزيع حتى من خليط العدوى عبر طبقة أحادية الخلية.
    12. 4-5 ساعة بعد الإصابة، إضافة 1.5 مل من الحشرات المتوسطة الخالية من المصل تكملها 10٪ (v/v) النهائي من الحرارة المعطل مصل البقر الجنين والمضادات الحيوية المضادة للmycotic إلى 1٪ (v/v) الحجم النهائي (100 وحدة / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام / مل من الستريبتومايسين، و 0.25 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B).
    13. احتضان الخلايا في حاضنة 27 درجة مئوية لمدة 72-96 ساعة. هز بلطف لوحات العدوى مرة واحدة في اليوم عندما يكون ذلك ممكنا.
    14. ابحث عن علامات العدوى (SOI) ، واضحة في الخلايا المتحولة عند 72-96 ساعة بعد العدوى(الشكل 2). نضع في اعتبارنا أن الخلايا المصابة سوف تبدأ في إنتاج الفيروس ومزيد من العدوى الثقافة; وبالتالي، ابحث عن علامات العدوى.
      ملاحظة: علامات العدوى هي تغييرات هيكلية في خلايا الحشرات ، مثل زيادة بنسبة 25-50٪ في قطر الخلية ، نواة الخلية الموسعة ، الشكل المستدير بشكل موحد ، فقدان الانتشار والالتزام بسطح طبق الثقافة ، وكذلك انخفاض في صلاحية الخلية (الشكل 2. فيروس باكولو المصابة وغير المصابة Sf9 الخلايا).

3. صغيرة -- نطاق البروتين التعبير الفحص وتضخيم الفيروس

  1. عدوى خلايا Sf9 مع الأسهم P1 baculovirus.
    ملاحظة: بعد 4-5 أيام من العدوى، يجب أن تكون علامات العدوى واضحة في الخلايا المصابة بالمقارنة مع الخلايا (غير المصابة) تحت المجهر المقلوب. وينبغي أن تكون الفيروسات baculo الأولية المؤتلفة التي تفرز في وسط زراعة الخلية جاهزة لجمع.
    1. البذور 2 × 105 خلايا Sf9 المتنامية أضعافا مضاعفة في وسائط الحشرات الخالية من المصل في كل بئر من لوحات 24 بئرا في حجم إجمالي قدره 2 مل للعدوى بفيروسات P1 لتضخيم حجم الفيروس (مما أدى إلى توليد فيروسات P2).
    2. بعد ماصة الخلايا في لوحات، صخرة بلطف لوحات، وذلك باستخدام الحركة ذهابا وإيابا لضمان طبقة واحدة حتى. لا تدور لوحات لأن الخلايا سوف تتجمع في وسط البئر.
    3. احتضان لوحات في 27 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح للالتزام الخلوية إلى لوحة.
    4. الاستغناء عن 4 مل من خلايا Sf9 بكثافة 3.5-4 × 106 في وسط خال من مصل الحشرات في كل بئر من كتل 24 بئرا لتصيب بفيروسات P1 لفحص التعبير البروتيني.
      ملاحظة: تسمية بئر واحد من لوحات 24 جيدا وكتل 24 جيدا والسيطرة واستخدامها كعنصر تحكم غير مصاب للمقارنة بين الخلايا المصابة وغير المصابة عند البحث عن SOI.
    5. استخدم قناة إلكترونية متعددة قابلة للبرمجة للسماح بجمع فيروسات P1 في وقت واحد (الخطوة 2.1.13) ، عدوى خلايا Sf9 الطازجة (الخطوة 3.1.1) والتهاب الخلايا المعلقة في الكتل ذات 24 بئرا (الخطوة 3.1.4) مع 150 ميكرولتر من فيروسات P1.
    6. تدور أسفل بقية المخزونات الفيروسية P1 التي تم جمعها لمدة 15 دقيقة في 17970 × ز، ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق وتخزينها في الظلام في 4 درجة مئوية.
    7. هز بلطف لوحات 24 جيدا (الخطوة 3.1.1) على شاكر الترددية لضمان توزيع حتى من الفيروسات P1 المضافة على أحادية الخلية; كرر ذلك عدة مرات خلال فترة الحضانة.
    8. قم بتغطية الكتل ذات ال 24 بئرا بثقافة التعليق لخلايا Sf9 المصابة (الخطوة 3.1.4) بورقة بخاخ.
    9. احتضان كتل 24 بئرا في 27 درجة مئوية، تهتز في 245 دورة في الدقيقة لمدة 72-96 ساعة.
    10. ابحث عن SOI في غضون 72-96 ساعة بعد وقت العدوى في لوحات 24 بئرا مع فيروسات P2 (الخطوة 3.1.1) وفي كتل 24 بئرا (الخطوة 3.1.4) مع الخلايا المصابة لفحص التعبير.
      ملاحظة: بعد 4-5 أيام من عدوى خلايا Sf9 بفيروسات P1 ، يجب أن يكون SOI واضحا في الخلايا المصابة بالمقارنة مع خلايا التحكم غير المصابة تحت المجهر المقلوب.
    11. جمع الفيروسات P2 من لوحات 24 بئرا، والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 17970 × ز،ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق وتخزينها في الظلام في 4 درجة مئوية.
    12. في 72-96 ساعة بعد العدوى، رش على كتل 24 جيدا مع الإيثانول 70٪، وجلب في غطاء محرك السيارة تدفق صفح، والتحقق من كثافة الخلية وقابلية البقاء في عدد قليل من الآبار عن طريق تلطيخ تريبان الأزرق.
    13. المضي قدما لتنقية البروتين إذا كانت الخلايا لديها علامات العدوى وقابلية البقاء على مقربة من 70-75٪ كما تم تقييمها من قبل تريبان الأزرق تلطيخ.
    14. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي كتل 24 بئرا في 525 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تجاهل supernatant وإعادة تعليق تماما الكريات في 1 مل من العازلة تحلل تتألف من 25 mM تريس pH 8.0، 300 mM NaCl، 0.6 ٪ NP-40, 2 mM imidazole, 5٪ الجلسرين (v/v) و1x كوكتيل مثبط البروتيز (100x كوكتيل مثبط البروتياز يضم aprotinin 0.25 ملغم / مل, leupeptin 0.25 ملغم / مل, pepstatin A 0.25 ملغم / مل; E-64 0.25 ملغم/مل).
    15. تخزين تعليق الخلية في -80 درجة مئوية لتنقية الاختبار اللاحقة (انظر 3.2.2).
  2. تنقية البروتين من تعليق الخلايا المجمدة في كتل اختبار التعبير 24 جيدا.
    1. تجميع كتلة الربط (الشكل 3).
      1. ضع 3 طبقات متداخلة من البارافيلم على الجزء العلوي من كتلة البئر العميقة البالغ عمقها 96 (بئر بعمق 96 2.4 مل).
      2. ضع لوحة فلتر 96 جيدا (لوحة تصفية دقيقة ، 96 جيدا ، بولي بروبلين مع 25 ميكرومتر غشاء البولي إيثيلين عالي الوزن الجزيئي) على الجزء العلوي من كتلة البئر العميقة 96.
      3. ادفع لوحة التصفية لأسفل لتأمين النصائح في البارافيلم لإغلاق لوحة التصفية من الكتلة العميقة 96 جيدا.
      4. نقل 50 ميكرولتر من الطين الراتنج ني-NTA 50٪ قبل التوازن في كل بئر من لوحة التصفية.
    2. اختبار إجراء التعبير
      1. ضع تعليق الخلية المجمدة (الخطوة 3.1.15) الموجود في كتل 24 بئرا في حمام مائي في RT لمدة 5-10 دقائق ، ثم يهز عند 450 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
      2. الطرد المركزي كتل 24 بئرا في 3275 × ز لمدة 15 دقيقة.
      3. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل الليسات مسح في لوحة تصفية تحتوي على 50 ميكروغرام من الطين الراتنج ني-NTA قبل التوازن 50٪ (الخطوة 3.2.1.4) وختم لوحة التصفية مع حصيرة سقف 96 جيدا (حصيرة سقف 96 جيدا، لاستخدامها مع بئر مربع، 2 مل).
        ملاحظة: استخدم بعض الأربطة المطاطية للحفاظ على الكتلة الملزمة معا أثناء خطوات الحضانة والطرد المركزي.
      4. ضع كتلة الربط المضمون لمدة 45-60 دقيقة في الدوار في غرفة باردة لاحتضان الlysates مسح مع راتنج ني-NTA.
      5. بعد الحضانة، ارفع لوحة الفلتر بعناية وأزل طبقة البارافيلم من سطح كتلة البئر التي يبلغ عمقها 96 بئرا (الخطوة 3.2.1.1).
      6. ضع لوحة التصفية مرة أخرى على قمة كتلة البئر العميقة 96 وتدور أسفل كتلة الربط المضمون لمدة 2 دقيقة عند 235 × ز.
      7. غسل السندات ني-NTA راتنج 2x مع 2 مل من العازلة الغسيل التي تتألف من 25 mM تريس pH 8.0, 300 mM NaCl, 5٪ الجلسرين, و 15 mM imidazole.
      8. قم بتدفير الكتلة مع مخزن الغسيل المؤقت في كل مرة لمدة 5 دقائق عند 235 × ز لضمان الإزالة الكاملة للسائل المتبقي.
      9. نقل لوحة التصفية على الجزء العلوي من لوحة PCR 96 جيدا تحتوي على 10 ميكرولتر من 4x تحميل صبغة.
      10. إضافة 40 ميكرولتر من العازلة elution (25 mM تريس درجة الحموضة 8.0، 300 mM NaCl، 5٪ الجلسرين، 500 mM imidazole) إلى كل بئر من لوحة مرشح واحتضان لمدة 5 دقائق.
      11. تدور أسفل كتلة لبروتينات elute في لوحة PCR 96 جيدا في 235 × ز لمدة 10 دقيقة.
      12. ختم لوحة PCR 96 جيدا مع درجة حرارة عالية مقاومة للحنفية وسادة والحرارة في 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
      13. تحميل 15 ميكرولتر من عينات البروتين eluted في العازلة Laemmli القياسية على هلام SDS-PAGE 4-20٪ بجوار سلم البروتين وتشغيل هلام مع المخزن المؤقت تشغيل القياسية التي تحتوي على SDS.
      14. وصمة عار الجل مع الأزرق Coomassie وإزالة وصمة عار بالماء. تحليل نتائج اختبار التعبير لتحديد أفضل التعبير عن بنيات للإنتاج على نطاق واسع.

4. الاستعدادات من خلايا الحشرات المصابة بفيروس الباكولو (SCBIIC) لإنتاج البروتين

  1. قبل 4 أيام من وقت الإنتاج المجدول، تقسيم خلايا Sf9 المتنامية أضعافا مضاعفة إلى كثافة الخلية النهائية من 2 × 106 خلايا / مل إلى 125 مل / 250 مل / 500 مل Erlenmeyer الزجاج يهز قوارير مع حيرات في 50 مل / 100 مل / 200 مل من الحشرات مصل خالية المتوسطة التي تحتوي على 1 ٪ (v / v) النهائي مضاد حيوي antimycotic.
  2. إضافة 0.150 مل / 0.300 مل / 0.6 مل من الفيروسات P2 المناسبة، واحتضان الخلايا المصابة في 165 دورة في الدقيقة على شاكر المداري مع السكتة الدماغية بوصة واحدة وفي درجة حرارة أقل من 25 درجة مئوية لإبطاء انقسام الخلية.
  3. في 4 أيام بعد العدوى، تحقق من الخلايا تحت المجهر ل SOI والمضي قدما في الإنتاج إذا كانت صلاحية الخلية كما تم التحقق منها مع بقعة تريبان الأزرق قريبة من 70-75٪.

5. SF9 الخلايا الاستعدادات لإنتاج البروتين على نطاق واسع

  1. قبل 4 أيام من وقت الإنتاج المجدول، احسب الحجم المطلوب من خلايا Sf9 لإنتاج البروتين على نطاق واسع.
  2. البذور 2 L من خلايا Sf9 المتنامية أضعافا مضاعفة في الحشرات مصل خالية المتوسطة إلى كثافة الخلية من 1 × 106 خلايا / مل في 2.8 L فرنباخ يهز قوارير.
  3. احتضان قوارير في 27 درجة مئوية مع اهتزاز مجموعة في 150 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: لمنع التلوث البكتيري في زراعة خلايا Sf9، استخدم جنتاميسين إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام/مل أو البنسلين/الستربتومايسين إلى 50 U/mL و50 ميكروغرام/مل، على التوالي.

6. عدوى خلايا Sf9 مع SCBIIS لإنتاج البروتين على نطاق واسع

  1. تقسيم 2 لتر أو 4 لتر من خلايا Sf9 المتنامية أضعافا مضاعفة في الحشرات المتوسطة الخالية من المصل إلى كثافة الخلية النهائية من 4 × 106 خلايا / مل في 2.5 لتر تونار يهز قوارير أو زجاجات كاشف 5 لتر.
  2. أضف 10-12 مل /لتر من ثقافة تعليق خلية الحشرات المصابة بفيروس البكولو (SCBIIC).
  3. احتضان الثقافة المصابة من خلايا SF9 على شاكر مع 145 دورة في الدقيقة في درجة حرارة أقل من 25 درجة مئوية (لإبطاء انقسام الخلايا) لمدة 72-96 ساعة.
  4. في 72 ساعة بعد العدوى، تحقق من الخلايا تحت المجهر ل SOI وتقييم صلاحية الخلية.
  5. عادة، بعد حوالي 72 ساعة بعد العدوى، وبقاء خلايا Sf9 تنخفض إلى 70٪-75٪ (تقاس باستخدام بقعة الأزرق تريبان). أصاب الحصاد خلايا Sf9 في زجاجة بول بروبلين 1 لتر عن طريق الطرد المركزي عند 900 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. Resuspend بيليه الخلية التي تم جمعها من 1 لتر من ثقافة خلايا الإنتاج مع 20-25 مل من برنامج تلفزيوني 1x عن طريق دوامة بلطف ونقلها إلى أنابيب مخروطية 50 مل.
  7. تدور أسفل تعليق الخلية في 900 × ز لمدة 15 دقيقة وتجاهل حل برنامج تلفزيوني.
  8. Resuspend بيليه الخلية المغسولة مع 20-25 مل من العازلة تعليق (20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.0, 500 mM NaCl, 5٪ الجليسيرول, 1x كوكتيل مثبطات البروتيز) وتجميد فلاش في النيتروجين السائل; تخزين في −80 درجة مئوية حتى تنقية.
    ملاحظة: وقد وصفت إجراءات تنقية PRMTs بالتفصيل في ورقة SGC المنشورة6.

Representative Results

ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن بروتوكول BEVS . تم إنشاء بنى تعبير متعددة من PRMTs ، بما في ذلك الطول الكامل ، والمجالات ، والشظايا المبتورة ، في اتحاد الجينوم الهيكلي (SGC ، تورونتو) وفقا لاستراتيجيات داخلية مع محاولة لزيادة معدل النجاح لتحديد البروتينات القابلة للذوبان والمستقرة مع مستوى تعبير مرتفع نسبيا7،9. يتم تشجيع القراء المهتمين على مراجعة تعريفات ومنهجية SGC لتصميم "جزء" كشريحة من التسلسل الجيني المدمج في استنساخ التعبير ، و "المجال" كمجال هيكلي مشروح PFAM ، و "بناء" كجزأ مستنسخ في متجه تعبير ، وكلها وصفت بالتفصيل في منشور سابق7. إن بنى التعبير من PRMTs المعروضة في هذا البروتوكول هي لإنتاج البروتينات الموسومة بالبوليهيستدين المستنسخة في ناقل pFBOH-MHL ، وهو مشتق من ناقل pFastBac1. في الشكل 4، نقدم تحليل SDS-PAGE للبنى القابلة للذوبان الموسومة من PRMT1 ، 2 ، 4-9 منقي من الكريات التي تم جمعها بعد 4 مل من الإنتاج في خلايا Sf9 (الخطوة 3.1.4). لم يتم تقديم كامل طول (فلوريدا) PRMT1 و PRMT9 في هذا الجل، منذ تم إنتاج FL PRMT1 من كولاي،وFL PRMT9 المنتجة من BEVS تم تنقيتها من قبل العلم العلامة6. تظهر البنى المبتورة من PRMT1 و FL PRMT4 وجميع بنيات PRMT8 عائدا مرتفعا نسبيا ، ولكن الملوات البروتينية تحتوي على أجزاء من الملوثات المنقية المشتركة. تتطلب هذه الإنشاءات تحسين بروتوكولات التنقية. ولذلك يلزم اتباع نهج إضافية لتحسين نقاء هذه البروتينات من زيادة الإنتاج، مثل تخفيض كمية حبات النيكل في مرحلة الحضانة مع توضيح اللذات؛ زيادة تركيزات إيميدازول في مخازن الغسيل؛ انشقاق له الوسم مع بروتياز TEV، تليها تطبيق على راتنج ني تقارب؛ وخطوات تنقية إضافية مثل استبعاد الحجم والكروماتوغرافيا التبادلية الأيونية. تظهر بنى PRMT2 عائدا أقل بكثير مقارنة بالبروتينات الأخرى وبروتين PRMT2 كامل الطول مصحوبا بنطاق ملوث قوي. وأكد توسيع الإنتاج وخطوتين من تنقية مثل IMAC وحجم الاستبعاد مستوى التعبير منخفضة لهذا البناء جنبا إلى جنب مع وجود مستمر من الملوثات تنقية مشتركة للبروتين فلوريدا. تم الحصول على البروتينات النقية لمجمع PRMT5 المنتجة وتنقية مع شريك ملزم ملزم، MEP50. يحتوي البناء المبتور ل PRMT9 على مستوى تعبير أقل بمقدار ضعفين أو ثلاثة أضعاف تقريبا ، بالقرب من 1.5 ملغ / لتر ، مقارنة ب PRMTs الأخرى. ومع ذلك، استخدمت المخزونات الفيروسية المؤتلفة من هذا البناء لتوسيع نطاق الإنتاج، تم الحصول على بلورات diffracting، وحلت هيكل لهذا البروتين جنبا إلى جنب مع PRMT4، 6، و 7 (الشكل 5).

بالنسبة للإنتاج الأعلى ، تم استخدام فيروسات P2 المقابلة لإصابة ثقافة التعليق لخلايا الحشرات Sf9. هذه الخطوة يولد 50/100/200 مل من الخلايا المصابة بالفيروسات الباكولو التي تحتوي على الخلايا المصابة وفيروسات P3 في supernatant. لإنتاج البروتين على نطاق واسع، تم استزراع 2 لتر من خلايا Sf9 في كل من قوارير اهتزاز فرنباخ 2.8 L عند 150 دورة في الدقيقة، 27 درجة مئوية (الشكل 6). في يوم الإنتاج، 2 لتر من خلايا Sf9 (صلاحية الخلية > 97٪) في 2.5 L Tunair هز قوارير أو 4 L في 5 زجاجات كاشف L تم تخفيفها إلى كثافة الخلية من 4 × 106/ مل. وقد أصيبت هذه الخلايا مباشرة ب 10-12 مل/لتر من زراعة التعليق لخلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو، وتم احتضانها بدرجة حرارة منخفضة تبلغ 25 درجة مئوية، عند 145 دورة في الدقيقة. العدوى دفعة الإنتاج مباشرة مع ثقافة تعليق خلايا الحشرات المصابة بالفيروسات البكولو خفضت بشكل كبير الخطوات الشاقة وتستغرق وقتا طويلا في تضخيم حجم الفيروس، باستثناء التعامل الإضافي مع الخلايا المصابة، وتجنب الحد من تدهور التيتر والفيروس. وقد تم SF9 خلية صيانة الثقافة وتوسيع الإنتاج في الأوعية ثقافة مع حجم تعبئة عالية لاعتماد إنتاج البروتين على نطاق واسع في دفعة واحدة(الشكل 6).

وقد استخدمت كامل طول PRMT 4، 5 (في مجمع مع MEP50)، 6، 7، و 9 البروتينات المنتجة من منصة الإنتاج بوساطة فيروس Baculo لتوصيف الحركية وفحص مركب المانع في SGC6. تم حل الهياكل البلورية وإيداعها في بنك بيانات البروتين (PDB) للأشكال الكاملة أو المبتورة من البروتينات PRMT 4 و 6 و 7 و 9 مع مسابير ومثبطات كيميائية مختلفة. تم إيداع البلازميدات التعبيرية لهذه PRMTs في مستودع أدجين بلازميد (أدجين هو شريك توزيع لSGC ، https://www.addgene.org/) ومتاحة لمجتمع البحوث(الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1:نظرة عامة تخطيطية لخطوات عملية التعبير عن الفيروسات الكولولية، يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: فيروس باكولو المصابة وغير المصابة SF9 الخلايا. علامات العدوى هي تغييرات هيكلية في خلايا الحشرات ، مثل زيادة بنسبة 25-50٪ في قطر الخلية ، ونوى الخلية الموسعة ، والشكل المستدير بشكل موحد ، وفقدان الانتشار ، والالتزام بسطح طبق الثقافة ، بالإضافة إلى انخفاض في صلاحية الخلية. شريط مقياس أبيض 200 ميكرومتر. علامات العدوى المعروضة هنا هي نفسها بالنسبة للخلايا المصابة باستخدام كل من الكواشف transfection، JetPrime وX-tremeGene 9. المثال المحدد الموضح هو لمشف العدوى عبر JetPrime. (أ) خلايا Sf9 غير المصابة كعنصر تحكم. (ب) خلايا SF9 المصابة بفيروس باكولو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:تجميع لوحة الربط لتنقية سريعة من البروتينات التعبير الاختبار. يرجى الاطلاع على نص التفاصيل، الخطوات 3.2.1-2 الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نتائج فحص التعبير البروتيني. نتائج فحص التعبير البروتيني لإنتاج البروتين بوساطة فيروس baculo في 4 مل من ثقافة تعليق Sf9 المصابة بالفيروسات المؤتلفة P1 المقابلة لمختلف PRMTs ومجمع PRMT5-MEP50. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:ملخص لبنى التعبير لPRMT4 و 6 و 7 و 9 المستخدمة لدراسات البنية البلورية في اتحاد الجينوم الهيكلي، تورونتو (SGC). تم حل الهياكل البلورية وإيداعها في بنك بيانات البروتين (PDB) لكامل طول أو أشكال مبتورة من البروتينات PRMT 4 و 6 و 7 و 9 مع مسابير ومثبطات كيميائية مختلفة. تم إيداع البلازميدات التعبيرية لهذه PRMTs في مستودع Addgene plasmid وهي متاحة لمجتمع الأبحاث (Addgene هو شريك توزيع ل SGC ، https://www.addgene.org/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: Sf9 صيانة خلايا الحشرات وإنتاج البروتين في الأوعية ثقافة مختلفة: (أ) 2.8 L قارورة فرنباخ لصيانة الخلايا وإنتاج البروتين. استخدام 72٪ ملء حجم يزيد من معدل الإنتاجية بنسبة 2.5 أضعاف في منصة واحدة اهتزاز. (ب)تونير يهز قوارير (فقط 9 قوارير من أصل 10 يتم تقديمها في هذه الصورة) وزجاجات كاشف مع 80٪ ملء حجم زيادة كبيرة في الطاقة الإنتاجية للمنصة تهتز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تركز إحدى مزايا BEVS في خلايا الحشرات على قدرة آلية التعديل بعد الترجمة على تمكين تعديلات أكثر تعقيدا مثل الفوسفور وال myristoylation والجيليكوزيليشن. جنبا إلى جنب مع للطي كفاءة عالية من البروتينات الثدييات، وهذه التعديلات تسهيل كميات عالية من البروتين المعدلة والمطوية مناسبة للتجارب المصب ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية16.

هنا ، وصفنا بروتوكولات مفصلة من BEVS التأكيد على العناصر الحاسمة لفحص التعبير الناجح لبنى متعددة من بروتينات PRMT وإنتاج البروتين PRMT على نطاق واسع في منصة التعبير Baculovirus: 1) استخدام العادية ، قابل للتعديل ، وبرمجة ماصة متعددة القنوات لنقل المواد البيولوجية بين 24- و 96 - لوحات زراعة الخلايا جيدا وكتل في مراحل الحمض النووي bacmid وتوليد الفيروسات؛ مجموعة من الفيروسات المؤتلفة ، تضخيم الأحجام الفيروسية للفيروسات المؤتلفة وإعداد كتل فحص التعبير البروتيني. 2) الأداء العالي والكواشف transfection فعالة من حيث التكلفة لتوليد الفيروسات المؤتلفة. 3) تعليق ثقافة خلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو (SCBIIC) لإنتاج البروتين على نطاق واسع. 4) استخدام حجم التعبئة العالية 2.8 L فرنباخ يهز قوارير للحفاظ على ثقافة تعليق SF9 و2.5 L Tunair يهز قوارير و 5 زجاجات كاشف L لإنتاج البروتين على نطاق واسع.

اعتبارات خاصة ومبررات لخطوات التحول والإصابة.
على الرغم من أن البروتوكول التجاري يوصي باستخدام 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة لتحويل واحد14، فإن كفاءة تحويل الخلايا المختصة DH10Bac E. coli التجارية عالية مثل 1 × 108 cfu / μg DNA ، لذلك نستخدم فقط 4 ميكرولتر. وهذا يكفي لكل محول للحصول على مستعمرات بيضاء منعزلة مؤتلفة لعزل الحمض النووي bacmid. تم بذر خلايا Sf9 الملتصقة في لوحة العدوى العابرة 24 جيدا بكثافة خلية 2 × 105 / مل في 0.5 مل من وسائط الحشرات الخالية من المصل. هذا الحجم يكفي لضمان تغطية حتى من سطح العمل من البئر. وفي الوقت نفسه، فإنه لا يضعف مزيج العدوى أكثر من اللازم، مما يعزز كفاءة العدوى. الكواشف Transfection غير سامة لخلايا SF9، وتبادل وسائل الإعلام ليست ضرورية. بدلا من تغيير الوسائط، يتم إضافة 1.5 مل إضافية من الوسائط التي تحتوي على 10٪ (v/v) FBS إلى لوحة العدوى في 4-5 ساعات بعد وقت العدوى لتسهيل نمو الخلايا. كفاءة العدوى من كل من الكواشف transfection عالية. ومع ذلك ، مع X - tremeGene 9 ، تظهر علامات العدوى في الخلايا المصابة (الشكل 2) 10-12 ساعة في وقت سابق مما كانت عليه مع كاشف JetPrime ، لذلك نختار بين هذه الكواشف اعتمادا على جدول العمل للخطوات التالية في البروتوكولات ، والتي توفر بعض المرونة في العملية الشاملة.

يمكن إعداد فحص التعبير عن اختبار البروتين مع فيروسات P2 إذا كانت كمية الفيروسات المؤتلفة الأولية ، التي تم جمعها من لوحة العدوى ووصفت بأنها P1 ، عاملا مقيدا لاستخدامه في فحص التعبير عن البروتين.

الاعتبارات عند الانتقال من أحجام الثقافة الصغيرة إلى الكبيرة.
تاريخيا، كان يعتقد أن نمو الخلايا الأمثل يتطلب مساحة جوية عالية في ثقافة التعليق من صيانة الخلايا SF9 وتوسيع نطاق الإنتاج. ومع ذلك ، في عام 2014 ، أفادت التقارير أن ارتفاع المساحة الجوية في السفن الثقافية أقل أهمية مما كان يعتقد سابقا17. سفينة الثقافة التي أنشئت باستخدام سرعة اهتزاز المعدلة بشكل مناسب لرمي المداري من منصة اهتزاز سيوفر نقل الأكسجين كافية حتى في ثقافة تعليق حجم التعبئة العالية من خلال خلق والحفاظ على فقاعات الهواء الصغيرة لفترة أطول. مع هذا النهج ، يمكن زراعة خلايا الحشرات المتاحة تجاريا بسرعة اهتزاز أعلى ضمن نطاق طبيعي من وقت مضاعفة الخلايا دون التضحية بقابلية الخلية العالية للحياة.

وهكذا، قبل 6 سنوات، بدأنا في زيادة حجم ثقافة التعليق في قارورة تهتز أثناء صيانة الخلية، وقدم نوع مختلف من وعاء الثقافة لإنتاج البروتين مع ضبط ورصد ظروف اهتزاز(الشكل 6). ولتهيئة الظروف المثلى في هذه الأوعية الثقافية، قمنا بمراقبة معلمات ثقافة الخلايا Sf9 مثل مضاعفة وقت مضاعفة الخلية إلى جانب صلاحية الخلية وحجمها وشكلها وحالة التجميع وقابلية الخلايا للعدوى.

على سبيل المثال، لصيانة الخلية Sf9، في 2.8 L فرنباخ يهز قوارير، ونحن ثقافة 2 L بدلا من 0.8 L من الخلايا تعليق SF9 تهتز في 150 دورة في الدقيقة في 27 درجة مئوية وقابلية بقاء الخلية معظم الوقت هو ما يقرب من 99٪، مع خلايا تقسيم صحية على شكل بالتساوي. لتوسيع نطاق الإنتاج، ونحن تصيب 4 لتر من الخلايا في زجاجات كاشف 5 لتر تهتز بسرعة عالية كما 145 دورة في الدقيقة في درجة حرارة خفضت من 25 درجة مئوية. يمكن أن تحمل الحاضنات الأكثر استخداما مع منصة اهتزاز مدمجة قوارير اهتزاز 6 × 2.8 لتر أو زجاجات كاشفة 6 × 5 لتر ، أو 10 × 2.5 لتر تونير يهز قوارير. وهكذا، فإن قدرة منصة اهتزاز واحدة، إذا كنا ملء قوارير فيرنباخ يهز وزجاجات كاشف إلى 1/3 مقابل لحجم التعبئة العالية من السفن هو 4.8 لتر مقابل 12 L باستخدام 2.8 L فرنباخ يهز قوارير و 10 L مقابل 24 L باستخدام زجاجات كاشف 5 لتر(الشكل 6). وقد ساعدتنا صيانة ثقافة الخلايا المعلقة وزيادة الإنتاج في سفن الثقافة ذات الحجم العالي على التغلب على قيود أحجام الإنتاج واعتماد منصة واسعة النطاق. وبالتالي، فإن هذا مفيد للغاية للمختبرات التي لا تتوفر لها إمكانية الوصول إلى المفاعلات الحيوية و/أو المساحة المحدودة في خطوط أنابيب الإنتاج.

يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لإنتاج وتنقية بنيات البروتين مع علامات تقارب مختلفة باستخدام الراتنجات المناسبة وتعديل مخازن تنقية كما هو موضح في ورقة SGC المنشورة6 للبروتينات كاملة الطول الموسومة بالعلم من PRMT4 و 7 و 9 ومجمع PRMT5-MEP50 الموسومة له وPRMT6. على الرغم من أننا نصف بروتوكول BEVS لعائلة PRMT من البروتينات ، يمكن تطبيق نفس النهج على أي عائلة بروتين أخرى.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا داليا بارسيت لوفجوي على أخذ الوقت لتقديم تعليقات قيمة وتعليقات انتقادية على المخطوطة وجميع زملائنا في SGC الذين عملوا مع عائلة بروتين PRMT المعبر عنها من نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو.

وSGC هي مؤسسة خيرية مسجلة (رقم 1097737) التي تتلقى الأموال من AbbVie، باير AG، بوهرنجر إنغلهايم، جينينتيك، جينوم كندا من خلال معهد أونتاريو للجينوم [OGI-196]، الاتحاد الأوروبي وEFPIA من خلال مبادرة الأدوية المبتكرة 2 التعهد المشترك [منحة EUbOPEN 875510]، يانسن، ميرك KGaA (الملقب EMD في كندا والولايات المتحدة)، فايزر، تاكيدا وصندوق ويلكوم [106169/ZZ14/Z].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.8L Nalgene  Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, Nalgene 29171-854 For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells
24-Well Blocks RB Qiagen 19583 For incubation of  4ml of suspension  Sf9 cells  for protein  expression screening
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul Biorad 5671095 For SDS-PAGe analysis of the purified proteins
50ml Reagent Reservoir Celltreat Scientific Products 229290  Reservoir used for diluted transfection reagent  and Sf9 cells suspension
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL Greiner Bio-One 381080 Used to cover 96 well block
96 well PCR plate Eppendorf 30129300
Bacto agar BD 214010 For LB-agar selection paltes
Airpore Tape Sheets Qiagen 19571 To cover 24 well blocks for protein expression screening
Allega X-15R Centrifuge Beckman Coulter 392932
Antibiotic Antimycotic (100x) Gibco 15240112
Bacmid DNA in-house non-catalog item Bacmid DNA for baculovirus production
Bluo-Gal, 1g Thermo Fisher 15519028
Beckman JLA 8.1000
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile Eppendorf 30722116 Tissue  culture treated plate
Cell Resuspension Solution 0.5 L Millipore Sigma LSKCRS500 For Bacmid DNA extraction
Cell Lysis Solution 0.5 L Millipore Sigma LSKCLS500 For Bacmid DNA extraction
CELLSTAR  Tissue Culture Plates, 96 well Greiner Bio-One 655180 For transfection mix
ClipTip 1250, filter reload, sterile ThermoFisher Scientific 94420818 Tips for  programmable and adjustable multichannel pipette
dNTP Mix (25 mM each) Thermo Fisher Scientific R1121
E1-ClipTip  Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL ThermoFisher Scientific 4672090BT Programmable and adjustable multichannel pipette
E4  XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL Ranin LTS EA6-300XLS Ranin adjustable multichannel pipette
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane Agilent 201005-100 For protein purification in expression screening
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L IBI Scientific SS-6003C For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells
Gentamicin 10x10ml BioShop 15750078
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Wisent Biocenter 080-450
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L Wisent Biocenter 301-045-LL Serum free insect cells growth medium
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain Expedeon Protein Solutions ISB1L-1L For protein gel (SDS-PAGE) staining
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% BioShop IPT001.100
JetPRIME Transfection Reagent  Provided with  jetPRIME buffer POLYPLUS TRANSFECTION Inc 114-01 For Sf9 cells transfection to generate baculovirus
Kanamycin Monosulfate BioShop KAN201.100
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& Sigma L3022-1KG
Masterblock 96 deep well 2.4mL Greiner Bio-One 780285-FD Used in the transformation and expression screening procedures
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml Thermo Fisher 10361012 Competent cells for bacmid DNA generation
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL Sartorius Sartorius 725240 12 channel pipette
Neutralization Solution, 0.5 L Millipore Sigma LSKNS0500 For bacmid DNA extraction
New Brunswick  Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) Eppendorf M1282-0004 Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells
Ni-NTA Agarose Qiagen 30250 For protein purification
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco LS15140122
PYREX  Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  500ml Pyrex 4444-500 For  suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  125ml Pyrex 4444-125 For suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  250ml Pyrex 4444-250 For suspension culture of Sf9 cells
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution Froggabio 21141
RNase A, 0.9 mL Millipore Sigma LSKPMRN30 For suspension buffer for bacmid DNA extraction
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads MP Biomedicals 115000550 For  spread  of bacterial  cells across the surface of an agar plate.
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) Ranin 30389253 Tips for ranin multichannel pipette
S.O.C. Medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian cytivalifesciences SH3039602 Addition to the serum free medim for  the transfected cells
Sf9 cells Thermo Fisher 12659017 Insect cells
Sfx-Insect Cell Culture Media Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) SH3027802 Serum free insect cells growth medium
Tape Pad Qiagen 19570 Tape Pad
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units New England Biolabs M0267L
Tetracycline Hcl BioShop TET701.10
Trypan Blue 0.4% Solution Gibco 15250061 For  assessment of cell viability
VITLAB  Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L VITLAB V100889 For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells
VWR  Digital Mini Incubator VWR 10055-006 Incubator for adherent Sf9 cells
VWR  Incubating Microplate Shaker VWR 97043-606 Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks
VWR Petri Dishes VWR CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA  Transfection Reagent  1.0 M Roche 6365787001 For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and relevance of arginine methylation. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
  2. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  3. Lorton, B. M., Shechter, D. Cellular consequences of arginine methylation. Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).
  4. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).
  5. Frankel, A., Brown, J. I. Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs. Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).
  6. Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Seña, C. C., Vedadi, M. Chemical probes for protein arginine methyltransferases. Methods. 175, 30-43 (2020).
  7. Savitsky, P., et al. High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience. Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).
  8. Gileadi, O., et al. Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation. New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).
  9. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5, 135 (2008).
  10. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
  11. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  12. Shrestha, B., et al. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).
  13. Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).
  14. Invitrogen Life Technologies. Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , Invitrogen Life Technologies. Carlsbad. (2010).
  15. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).
  16. Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. Protein Production Using the Baculovirus Expression System. Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).
  17. Rieffel, S., et al. Insect cell culture in reagent bottles. MethodsX. 1, 155-161 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 173، البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراسيس، PRMTs، نظام ناقلات التعبير عن الفيروس الكولو، BEVS، خلايا الحشرات Spodoptera frugiperda، البروتين المؤتلف، الكواشف العابرة، ثقافة التعليق لخلايا الحشرات المصابة بفيروس البكولو، SCBIIC، 2.8 L فرنباخ قارورة الثقافة، 2.5 L قارورة تونار، 5 زجاجات L
إنتاج بروتينات PRMT المؤتلفة باستخدام نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hutchinson, A., Seitova, A.… More

Hutchinson, A., Seitova, A. Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System. J. Vis. Exp. (173), e62510, doi:10.3791/62510 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter