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Biochemistry

बाकुलोवायरस एक्सप्रेशन वेक्टर सिस्टम का उपयोग करके रिकॉम्बिनेंट पीआरएमटी प्रोटीन का उत्पादन

Published: July 17, 2021 doi: 10.3791/62510
Automatic Translation
1, 1
1Structural Genomics Consortium, University of Toronto

Summary

बैकुलोवायरस एक्सप्रेशन वेक्टर सिस्टम (बीईवीएस) बायोकेमिकल, बायोफिजिकल और स्ट्रक्चरल स्टडीज के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेसेस (पीआरएमटीएस) की अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और उत्पादन के लिए एक मजबूत मंच है। सामग्री की मिलीग्राम मात्रा पीआरएमटी के बहुमत और रुचि के अन्य प्रोटीन के लिए उत्पादित की जा सकती है जिसमें यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति मंच की आवश्यकता होती है।

Abstract

प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेसेस (पीआरएमटीएस) मेथिलेट आर्जिनिन अवशेषों पर विभिन्न प्रकार के प्रोटीन हैं जो कई सेलुलर प्रक्रियाओं में भूमिका निभाते हैं। पीआरएमटीएस या तो मोनो-या डाइमेथिलेट आर्जिनिन ग्वानिडिनो समूह सममित या विषम रूप से कर सकते हैं। इन प्रोटीनों की एंजाइमोलॉजी एक जटिल और तीव्रता से जांच किया गया क्षेत्र है जिसके लिए उच्च गुणवत्ता वाले पुनर्संयोजन प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा की आवश्यकता होती है। बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर प्रणाली (बीईवीएस) ऑटोग्राफा कैलिफोर्निका मल्टीपल न्यूक्लियोपोलिहेड्रोवायरस (एसीएमएनपीवी) और स्पोडोप्टेरा मितव्ययीपेंडा 9 (एसएफ9) कीट कोशिकाओं का उपयोग पीआरएमटी 1, 2 और 4 से 9 सहित कई पीआरएमटी की अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और उत्पादन के लिए किया गया है। इन प्रोटीनों के कई निर्माणों की अभिव्यक्ति के लिए एक साथ स्क्रीन करने के लिए, डोमेन और कटे हुए टुकड़ों के साथ-साथ पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन सहित, हमने समायोज्य और प्रोग्रामेबल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करते हुए स्केलेबल तरीकों को लागू किया है, जो 24-और 96-अच्छी प्लेटों और ब्लॉकों के साथ संयुक्त है। कुल मिलाकर, इन विधि समायोजनों ने बड़े पैमाने पर बैकमिड डीएनए, पुनः संयोजन वायरस और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग की पीढ़ी को सक्षम किया। Sf9 सेल निलंबन की एक उच्च भरने की मात्रा के साथ संस्कृति जहाजों का उपयोग करने के लिए एक बैच बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए उत्पादन पाइपलाइन में अंतरिक्ष सीमाओं को दूर करने में मदद की । यहां, हम जैव रासायनिक, जैव भौतिक और संरचनात्मक अध्ययनों के लिए कार्यात्मक पीआरएमटी की कुशल और लागत प्रभावी अभिव्यक्ति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Introduction

प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेसेस (पीआरएमटीएस) मेथिलेट आर्जिनिन अवशेषों को मोनोमिथाइल या सममित/असममित डिमेथाइल फैशन में । दोहराव आरजी/आरजीजी/जीआरजी दृश्यों को अधिकांश पीआरएमटीएस द्वारा अत्यधिक पसंद किया जाता है और इसमें विभिन्न प्रकार के प्रोटीन पाए जाते हैं1,2. आर्जिनिन मिथाइलेटेड प्रोटीन जैसे हिटोन या ट्रांसक्रिप्शन कारक और स्प्लिसिंग कारक ट्रांसक्रिप्शन, स्प्लिसिंग और क्रोमेटिन संरचना3,4को विनियमित करते हैं। पीआरएमटीएस के सब्सट्रेट और कोफैक्टर उपयोग, टर्नओवर और काइनेटिक्स के विविध नियमन के बढ़ते ज्ञान के साथ-साथ चयनात्मक अवरोधकों की पीढ़ी ने इन एंजाइमों और उनके परिसरों5,6पर मशीनी प्रकाश डाला है। हालांकि, सभी पीआरएमटी परिवार के सदस्यों का एक ही हद तक अध्ययन नहीं किया जाता है; उदाहरण के लिए, PRMT9 केवल हाल ही में PRMT परिवार1के एक सदस्य होने की खोज की थी । इन प्रोटीनों के लिए संरचना और एंजाइम कार्य अध्ययन के लिए पर्याप्त, अक्सर मिलीग्राम, पुनर्संयोजन प्रोटीन की मात्रा उपलब्ध होने की आवश्यकता होती है।

एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई)प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणाली आमतौर पर अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए पहली पसंद है जिसमें दिए गए प्रोटीन 7,8, 9 के लिए कई संरचनाओं का उपयोग कियाजाताहै । हालांकि, ई. कोलाई-आधारितअभिव्यक्ति हमेशा उनके सक्रिय रूपों में पीआरएमटी प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में परिणाम नहीं देती है, जैसा कि हमने विशेष रूप से PRMT5 और PRMT7 के लिए उल्लेख किया है (नीचे देखें)। इस प्रकार, पीआरएमटी जो ई. कोलाई में व्यक्त करने में विफल रहे हैं या यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति मशीनरी द्वारा उत्पादित किए जाने की आवश्यकता है, वैकल्पिक बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर सिस्टम (बीईवीएस) में अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त वैक्टर में उप-संरक्षित थे। जबकि ई कोलाई ने पीआरएमटी 1, पीआरएमटी 3 और पीआरएमटी8 के नमूनों को इन विट्रो परख और क्रिस्टलोग्राफी के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, पीआरएमटी 5 जैसे अन्य पीआरएमटी, जिसके लिए अपने दोहरे मिथाइलट्रांसफरेज डोमेन के एमईपी 50 बाध्यकारी साथी की आवश्यकता होती है, और पीआरएमटी7 और 9 जैसे पीआरएमटी, सक्रिय प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए कीट कोशिका अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। कुल मिलाकर, PRMT4, 5, 6, 7 और 9 के लिए मानकीकृत मध्यम-थ्रूपुट मिथाइलट्रांसफरेज परख ने कीट कोशिकाओं6में बीईवीएस का उपयोग किया है। बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर प्रणाली (बीईवीएस) यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति मशीनरी की आवश्यकता वाले पुनर्संयोजन प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक बहुमुखी मंच है जो जैव रासायनिक, जैव भौतिकीय और संरचनात्मक अध्ययन10, 11, 12के लिए आवश्यक अनुवादात्मक संशोधनों को सक्षम बनाता है। प्रोटीन अभिव्यक्ति13के लिए 1983 में बाकुलोवायरस के पहले उपयोग की सूचना के बाद से कई बीईवीएस व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं । इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड को कीट कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के लिए विभिन्न रणनीतियों को नियोजित करते हैं। इनमें बीएसी-टू-बीएसी, फ्लैशबैक, बाकुलोगोल्ड ब्राइट, बैकवेक्टर-3000, बैकमैजिक, बैकपाक आदि शामिल हैं। हमारा प्रोटोकॉल बीईवीएस में सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली प्रणाली पर आधारित है, बीएसी-टू-बीएसी सिस्टम14,जिसे जीन/सीडीएनए को ब्याज के प्रोटीन (पीओआई, यहां पीआरएमटीएस) को साइट-विशिष्ट पक्षांतरण15के माध्यम से ई कोलाई के एक विशेष तनाव में बनाए रखा गया है।

संक्षेप में, ब्याज के जीन युक्त प्लाज्मिड ट्रांसफर वेक्टर को पुनः संयोजन वायरल बैकमिड डीएनए उत्पन्न करने के लिए DH10Bac ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में बदल दिया गया था। इसके बाद अनुयायी एसएफ 9 कोशिकाओं को बैकमिड डीएनए से संक्रमित किया गया । ट्रांसफेक्शन के चार से पांच दिन बाद, सेल कल्चर मीडियम में स्रावित प्रारंभिक रिकॉम्बिनेंट बाकुलोवायरस बरामद किए गए और उन्हें पी1 वायरस के रूप में लेबल किया गया । P1 baculovirus स्टॉक्स तो वायरस प्रवर्धन (यानी, P2 baculovirus शेयरों की पीढ़ी) और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया । अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग परिणामों के आधार पर, प्रोटीन के सर्वोत्तम अभिव्यक्ति निर्माण के लिए पी 2 वायरस की पहचान की गई और बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं (एससीबीआईआईएस) की निलंबन संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया। यहां, हम अपने विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और वांछित पुनर्संयोजन प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए अधिक समय-कुशल, लागत कुशल और स्केलेबल पद्धति विकसित करने की हमारी रणनीति का समर्थन करने के लिए हमारे अभिकर्षक और संस्कृति पोत विकल्पों के पीछे के औचित्य का वर्णन करते हैं।

Protocol

नोट: बीईवीएस प्रोटोकॉल चरणों का अवलोकन चित्र 1में रेखांकित किया गया है ।

1. एक पुनर्संयोजन बैकमिड डीएनए की पीढ़ी

  1. DH10Bac परिवर्तन के लिए पौंड आगार चयनात्मक प्लेटों की तैयारी
    1. एलबी एगर प्लेटें तैयार करें जिनमें शामिल हैं: ५० μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracycline, २०० μg/mL Bluo-gal, और ४० μg/mL IPTG DH10Bac ट्रांसफॉर्मेडेंट्स के लिए चयन करने के लिए ।
    2. 25 ग्राम प्रीमिक्स्ड एलबी शोरबा और 13 ग्राम बैक्टो एगर का वजन करें और 2 एल फ्लास्क में डाल दें। वॉल्यूम को डिस्टिल्ड वॉटर के साथ 1 एल और ऑटोक्लेव को 121 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए लाएं।
    3. 50 डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान करें और 40-60 मिनट के लिए पानी स्नान में ऑटोक्लेव किए गए एगर समाधान को ठंडा करें जब तक कि यह 50-55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा न हो जाए।
    4. ठंडा समाधान करने के लिए, 7 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए gentamicin जोड़ें, 50 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए kanamycin, 10 μg/mL, Bluo-gal की अंतिम एकाग्रता के लिए 10 μg/mL, Bluo-gal की अंतिम एकाग्रता के लिए tetracycline, और आईपीटीजी 40 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए ।
    5. 50 एमएल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक 60 मिमी प्लेट में मध्यम के एगर समाधान और एलिकोट 7-10 एमएल मिलाएं। प्लेटों को कठोर करने के लिए कमरे के तापमान (2 घंटे) पर बैठने दें। उलटा, लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एंटीबायोटिक दवाओं युक्त प्लेटें 4 सप्ताह तक के लिए स्थिर हैं।
  2. DH10Bac ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में प्लाज्मिड का परिवर्तन
    1. सक्षम कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा की गणना करें।
    2. बर्फ पर सक्षम कोशिकाओं को पिघलाएं, धीरे-धीरे नीचे स्पिन करें और कोमल दोहन द्वारा वापस पुनर्व्यवसित करें।
    3. 96-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के 4 माइक्रोन बांटने के लिए 12-चैनल पिपेट का उपयोग करें।
    4. सक्षम कोशिकाओं में पुनर्संयोजन प्लाज्मिड डीएनए के ~ 0.3-0.5 माइक्रोग्राम जोड़ें और टैप करके धीरे-धीरे मिलाएं। मिश्रण को बर्फ पर 10-15 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
    5. हीट-शॉक एक पीसीआर मशीन में 45 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण। 2 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें।
    6. 96-वेल ब्लॉक (96-डीप वेल 2.4 एमएल) के प्रत्येक कुएं में एसओसी माध्यम के 0.5 एमएल को वितरित करें।
    7. बदल बैक्टीरियल सस्पेंशन को ब्लॉक के संबंधित कुएं में स्थानांतरित करने के लिए 12-चैनल पिपेट का उपयोग करें और इसे एयरपोर शीट से कवर करें।
    8. 4-5 घंटे के लिए मध्यम आंदोलन (205 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में ब्लॉक रखें।
    9. समान रूप से बाँझ कांच के मोतियों का उपयोग कर पौंड आगर प्लेट की सतह पर संस्कृति के 30-50 μL फैल गया । बाकी कल्चर को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    10. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि नीले/सफेद उपनिवेशों का रंग प्रत्यक्ष (40-48 एच) न हो जाए। जब पर्याप्त सफेद, बड़ी उपनिवेशों को प्लेट पर प्राप्त किया जाता है तो संस्कृति को त्याग दें।
    11. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सफेद उपनिवेशों में केवल पुनः संयोजन बैकमिड डीएनए होता है, फेनोटाइप को सत्यापित करने के लिए एंटीबायोटिक्स, ब्लू-गल और आईपीटीजी युक्त ताजा पौंड आगर प्लेटों पर एक अलग-थलग सफेद कॉलोनी को फिर से लकीर।
    12. 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    13. पुनर्संयोजन बैकमिड डीएनए की निकासी के लिए एक पुनः लकीर प्लेट से एक सत्यापित सफेद कॉलोनी उठाओ।
  3. रीकॉम्बिनेंट बैकमिड डीएनए को अलग करना
    1. एलबी मीडियम के 3 एमसीएल में एक सिंगल, पृथक सफेद कॉलोनी को 50 माइक्रोग्राम/एमएल कनामाइसिन, 7 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामिसिन, और 24-वेल ब्लॉक (24-अच्छी तरह से ब्लॉक राउंड बॉटम) में 10 μg/mL टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक किया जाता है और एक एयरपोर शीट के साथ कवर किया जाता है।
    2. 250 आरपीएम पर मिलाते हुए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें।
    3. 10 मिनट के लिए 2,100 x ग्राम पर 24-वेल ब्लॉककंपेज। सुपरनैंट को डिकंट करें, ब्लॉक को उलट दें, और एक शोषक ऊतक पेपर पर धीरे-धीरे टैप करें। प्रत्येक कुएं में 250 माइक्रोन का समाधान 1 (सेल रीस्पेशन समाधान) जोड़ें।
    4. टेप पैड या किसी अन्य सीलिंग फिल्मों के साथ ब्लॉक सील और उन्हें 5-10 मिनट के लिए 75 आरपीएम पर एक मिलाते हुए मंच पर जगह है। 1 एमएल टिप का उपयोग करके, उचित सेल लाइसिस सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जांचें, और यदि आवश्यक हो तो पुनर्निर्भर करें।
    5. प्रत्येक कुएं में समाधान 2 (सेल लाइसिस समाधान) के 250 माइक्रोन जोड़ें, ब्लॉकों को सील करें, और 30 एस के लिए 75 आरपीएम पर एक हिलते हुए मंच पर रखें (नमूनों के क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए, 24-अच्छी तरह से ब्लॉक न करें) 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटिंग करें।
    6. समाधान 3 (बेअसर समाधान) के 250 μL जोड़ें, ब्लॉक सील, और 30 s के लिए 75 आरपीएम पर मिलाते हुए मंच पर जगह है। प्रोटीन और ई कोलाई जीनोमिक डीएनए का एक मोटा सफेद वर्षा बनेगी । 10-15 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना रखें।
    7. सफेद वर्षा सामग्री को कसकर गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,100 x ग्राम पर 60 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। अपकेंद्रित्र के दौरान, एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को लेबल करें और पूर्ण आइसोप्रोपेनॉल के 0.8 एमएल जोड़ें।
    8. किसी भी सफेद तेज़ सामग्री से बचते हुए, आइसोप्रोपैनॉल युक्त ट्यूब में सुपरनेट को धीरे-धीरे स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे ट्यूब को कई बार उलटा करके मिलाएं और फिर 5 से 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। इस स्तर पर, नमूना रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 एक्स ग्राम पर 15 मिनट के लिए नमूना सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट निकालें और प्रत्येक ट्यूब में 70% इथेनॉल का 0.5 एमएल जोड़ें। पैलेट धोने के लिए कई बार ट्यूब को उलटा करें। कमरे के तापमान पर 14,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। (वैकल्पिक: दोहराने धोने)
    10. प्लाज्मिड तैयारी की बंध्यता सुनिश्चित करने के लिए लेमिनार प्रवाह हुड के अंदर नमूने लाएं और जितना संभव हो उतना सुपरनैंट को हटा दें।
      नोट: गोली ट्यूब के नीचे से उखाड़ फेंकना हो सकता है, इसलिए सुपरनेट को त्यागते समय सावधानी से गोली देखें।
    11. हवा सूखी 15-20 मिनट के लिए लेमिनार प्रवाह हुड के अंदर गोली और फ़िल्टर एल्यूशन बफर, 10 mM Tris-Cl, पीएच ८.५ के ५० μL में डीएनए भंग (सुनिश्चित करें कि छर्रों अधिक सूखे नहीं हैं) ।
    12. चूंकि डीएनए के कतरनी से बचने के लिए, पुनः संयोजन बैकमिड डीएनए आकार में 135 केबी से अधिक है, इसलिए कोमल दोहन द्वारा गोली को भंग करें।
    13. बैकमिड डीएनए में रुचि के जीन की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए, पीसीआर रिएक्शन मिक्स को 96-अच्छी पीसीआर प्लेट में स्थापित करें।
    14. पीसीआर मिश्रण को इस प्रकार तैयार करें: 1 माइक्रोन बफर, 0.2 माइक्रोन (10 mm प्रत्येक) DNTPs, ताक़ डीएनए पॉलीमरेज का 0.1 माइक्रोन, फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर (BACV2FWD: tattccggattattcataccg) का 0.1 माइक्रोन (25 माइक्रोन); BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggggc, 1 माइक्रोन बैकमिड डीएनए और 8 माइक्रोन पानी।
    15. 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए प्रारंभिक डेनैचुरेशन के साथ लक्ष्य जीन का प्रवर्धन करें, इसके बाद 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 30 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट/केबी के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
    16. 72 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए एक अंतिम विस्तार के बाद प्रतिक्रिया समाप्त।
    17. इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा न्यूक्लिक एसिड स्टेनिंग समाधान युक्त 1% (w/v) एगर उठे हुए जेल पर प्रवर्धन उत्पाद के 10 माइक्रोन का विश्लेषण करें।
    18. सत्यापित बैकमिड डीएनए को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. पुनर्संयोजन बाकुलोवायरस शेयरों का उत्पादन

नोट: बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल के किसी भी कदम के लिए 95% या उससे अधिक की व्यवहार्यता के साथ तेजी से बढ़ती Sf9 कोशिकाओं का उपयोग करें, जिसमें बाकुलोवायरस पीढ़ी के लिए सेल ट्रांसफैक्शन, बाकुलोवायरस वॉल्यूम प्रवर्धन, प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और प्रोटीन उत्पादन शामिल हैं।

  1. बैकमिड डीएनए और ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स (टीआर) जैसे जेटप्राइम या एक्स-ट्रेमेजीन 9 के साथ एसएफ9 कोशिकाओं का ट्रांसफैक्शन।
    नोट: ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग व्यवहार्य सेल काउंट और% सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। गैर-व्यवहार्य कोशिकाएं दाग लेती हैं और माइक्रोस्कोप के नीचे नीले दिखाई देती हैं जबकि व्यवहार्य कोशिकाएं दागदार रहती हैं । % सेल व्यवहार्यता की गणना करने के लिए, कुल सेल काउंट (अन दाग और दाग) प्राप्त किया जाता है और व्यवहार्य सेल काउंट को कुल सेल गणना से विभाजित किया जाता है और 100 से गुणा किया जाता है।
    1. सीरम मुक्त कीट मीडिया में 4 x 105 कोशिकाओं/एमएल के अंतिम कोशिका घनत्व के लिए तेजी से बढ़ती Sf9 कोशिकाओं को पतला करें और बाँझ अभिवाक जलाशय में डालें ।
    2. 24-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला एसएफ 9 कोशिकाओं के 0.5 एमएल बीज के लिए एक प्रोग्रामेबल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
    3. एक नियंत्रण (असंक्रमित) के रूप में प्लेट के एक अच्छी तरह से लेबल और संक्रमण के संभावित संकेतों के लिए आकलन करने के लिए संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं की तुलना करने के लिए इसे एक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें।
    4. कोशिकाओं को प्लेटों में बोने के बाद, कोशिकाओं के एक भी मोनोलेयर को सुनिश्चित करने के लिए प्लेटों को कई बार आगे और पीछे रॉक करें। प्लेटों को चक्कर न लगाएं क्योंकि कोशिकाएं कुएं के केंद्र में क्लस्टर होंगी।
    5. संस्कृति प्लेटों के लिए सेल लगाव के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    6. ट्रांसफैक्शन रीएजेंट शीशी को अच्छी तरह मिलाएं। प्रत्येक ट्रांसफैक्शन के लिए, ट्रांसफैक्शन बफर के 100 माइक्रोन में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 2 माइक्रोन जोड़ें। किसी अन्य बिना लागू कीट माध्यम का भी उपयोग किया जा सकता है। एक बाँझ अभिकर्ण जलाशय में पतला ट्रांसफेक्शन अभिकर्ण जमा करें और धीरे-धीरे 10 एस के लिए मिलाएं।
    7. 12-चैनल पिपेट का उपयोग करके, पतला ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 102 माइक्रोल को बाँझ 96-माइक्रोवेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
    8. एक 96-वेल माइक्रोवेल प्लेट के संबंधित कुएं में पुनः संयोजन बैकमिड डीएनए के 0.2 μg/μL समाधान के 10 μL को स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे मिलाते हुए (टैपिंग) प्लेट को किनारों से मिलाते हुए मिलाएं।
    9. जटिल गठन को सक्षम करने के लिए 15-20 मिनट के लिए ट्रांसफैक्शन मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    10. 96-और 24-अच्छी प्लेटों के बीच हस्तांतरण के लिए डिज़ाइन किए गए समायोज्य 6-चैनल पिपेट का उपयोग करके, 27 डिग्री सेल्सियस पर 4-5 घंटे के लिए ट्रांसफैक्शन प्लेटों के संबंधित कुओं में ड्रॉपवाइज कोशिकाओं पर ट्रांसफेक्शन मिश्रण जोड़ें।
    11. सेल मोनोलेयर पर ट्रांसफेक्शन मिश्रण का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए इनक्यूबेशन समय के दौरान कई बार प्लेटों को धीरे-धीरे रॉक करें।
    12. 4-5 घंटे ट्रांसफेक्शन के बाद, 1.5 एमएल कीट सीरम-मुक्त माध्यम को 10% (v/v) के साथ पूरक किया गया गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक को 1% (v/v) अंतिम मात्रा (100 यूनिट/एमएल पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन का 100 μg/एमएल, और एम्फोटेरिसिन बी का 0.25 μg/mL)।
    13. कोशिकाओं को 72-96 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। जब संभव हो तो दिन में एक बार ट्रांसफैक्शन प्लेटों को धीरे-धीरे रॉक करें।
    14. संक्रमण के लक्षणों (एसओआई) की तलाश करें, जो 72-96 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन(चित्रा 2)पर संक्रमित कोशिकाओं में स्पष्ट है। ध्यान रखें कि संक्रमित कोशिकाएं वायरस का उत्पादन शुरू कर देंगी और संस्कृति को और संक्रमित करेंगी; इस प्रकार, संक्रमण के संकेतों की तलाश करें।
      नोट: संक्रमण के लक्षण कीट कोशिकाओं में संरचनात्मक परिवर्तन हैं, जैसे कोशिका व्यास में 25-50% की वृद्धि, बढ़े हुए कोशिका नाभिक, समान रूप से गोल आकार, प्रसार की हानि और संस्कृति पकवान सतह का पालन, साथ ही सेल व्यवहार्यता में कमी(चित्रा 2। बाकुलोवायरस संक्रमित और असंक्रमित Sf9 कोशिकाएं)।

3. छोटे पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और वायरस प्रवर्धन

  1. P1 baculovirus स्टॉक के साथ Sf9 कोशिकाओं का संक्रमण।
    नोट: ट्रांसफैक्शन के 4-5 दिन बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत नियंत्रण (असंक्रमित) कोशिकाओं की तुलना में संक्रमण के लक्षण संक्रमित कोशिकाओं में स्पष्ट होने चाहिए। सेल कल्चर मीडियम में स्रावित प्रारंभिक रीकॉम्बिनेंट बाकुलोवायरस को इकट्ठा करने के लिए तैयार होना चाहिए।
    1. बीज 2 x 105 तेजी से बढ़ रही Sf9 कोशिकाओं सीरम मुक्त कीट मीडिया में 24 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं में P1 वायरस के साथ संक्रमण के लिए 2 मिलीएल की कुल मात्रा में वायरस की मात्रा बढ़ाना (P2 वायरस की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप) ।
    2. प्लेटों में कोशिकाओं को पाइपिंग करने के बाद, प्लेटों को धीरे-धीरे रॉक करें, एक भी मोनोलेयर सुनिश्चित करने के लिए आगे और पीछे की गति का उपयोग करें। प्लेटों को चक्कर न लगाएं क्योंकि कोशिकाएं कुएं के केंद्र में क्लस्टर होंगी।
    3. प्लेट को सेलुलर पालन के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    4. प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए पी 1 वायरस से संक्रमित करने के लिए 24-वेल ब्लॉक के प्रत्येक कुएं में कीट सीरम मुक्त माध्यम में 3.5-4 x 106 के घनत्व पर Sf9 कोशिकाओं के 4 एमएल बांटना ।
      नोट: एसओआई की तलाश में संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं की तुलना के लिए असंक्रमित नियंत्रण के रूप में नियंत्रण और उपयोग के रूप में 24-अच्छी तरह से प्लेटों और 24-अच्छी तरह से ब्लॉकों में से एक को लेबल करें।
    5. पी 1 वायरस (चरण 2.1.13), हौसले से वरीयता प्राप्त एसएफ 9 कोशिकाओं (चरण 3.1.1) के संक्रमण और पी 1 वायरस के 150 L के साथ 24-वेल ब्लॉक (चरण 3.1.4) में निलंबन कोशिकाओं के संक्रमण की अनुमति देने के लिए एक प्रोग्रामेबल इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल का उपयोग करें।
    6. 17,970 x gपर 15 मिनट के लिए एकत्र पी 1 वायरल स्टॉक के बाकी नीचे स्पिन करें, उन्हें माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।
    7. सेल मोनोलेयर पर जोड़े गए P1 वायरस का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक विनिमय शेखर पर 24-अच्छी प्लेटों (चरण 3.1.1) को धीरे से रॉक करें; इनक्यूबेशन समय के दौरान इसे कई बार दोहराएं।
    8. एक एयरपोर शीट के साथ संक्रमित Sf9 कोशिकाओं (चरण 3.1.4) की निलंबन संस्कृति के साथ 24-अच्छी तरह से ब्लॉक को कवर करें।
    9. 24-वेल ब्लॉक 27 डिग्री सेल्सियस पर, 72-96 घंटे के लिए 245 आरपीएम पर मिलाते हुए।
    10. P2 वायरस (चरण 3.1.1) के साथ 24-अच्छी प्लेटों में संक्रमण के समय के बाद 72-96 घंटे के भीतर SOI के लिए देखो और अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए संक्रमित कोशिकाओं के साथ 24-अच्छी तरह से ब्लॉक (चरण 3.1.4) में।
      नोट: पी 1 वायरस के साथ Sf9 कोशिकाओं के संक्रमण के 4-5 दिन बाद, SOI संक्रमित कोशिकाओं में स्पष्ट होना चाहिए जब एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत गैर संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में ।
    11. 24-अच्छी प्लेटों से पी 2 वायरस ले लीजिए, 17,970 x ग्रामपर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, उन्हें माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।
    12. 72-96 एच पोस्ट-इंफेक्शन पर, 70% इथेनॉल के साथ 24-वेल ब्लॉक पर स्प्रे करें, लैमिनार फ्लो हुड में लाएं, और ट्राइपैन ब्लू धुंधला द्वारा कुछ कुओं में सेल घनत्व और व्यवहार्यता की जांच करें।
    13. प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ें यदि कोशिकाओं में संक्रमण के लक्षण हैं और व्यवहार्यता 70-75% के करीब है जैसा कि ट्राइपैन ब्लू धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया जाता है।
    14. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 525 x ग्राम पर 24-वेल ब्लॉक अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। सुपरनेट को त्यागें और लाइसिस बफर के 1 एमसीएल में छर्रों को अच्छी तरह से निलंबित करें जिसमें 25 एमएम ट्रिस पीएच 8.0, 300 एमएन एनएसीएल शामिल हैं, 0.6% एनपी-40, 2 m imidazole, 5% ग्लाइसेरोल (v/v) और 1x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (100x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल 0.25 मिलीग्राम/एमएल, ल्यूपेप्टिन 0.25 मिलीग्राम/एमएल, पेपस्टैटिन ए 0.25 मिलीग्राम/एमएलएमएल; शामिल हैं। ई-64 0.25 मिलीग्राम/एमएल) ।
    15. बाद के परीक्षण शुद्धिकरण के लिए सेल निलंबन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (3.2.2 देखें)।
  2. 24-वेल टेस्ट-एक्सप्रेशन ब्लॉक्स में फ्रोजन सेल सस्पेंशन से प्रोटीन शुद्धिकरण।
    1. बाध्यकारी ब्लॉक की विधानसभा(चित्रा 3)।
      1. 96-डीप वेल ब्लॉक (96-डीप वेल 2.4 एमएल) के शीर्ष पर पैराफिल्म की 3 ओवरलैपिंग परतें रखें।
      2. 96-डीप वेल ब्लॉक के शीर्ष पर 96-वेल फिल्टर प्लेट (फिल्टर माइक्रोप्लेट, 96-वेल, पॉलीप्रोपाइलीन को 25 माइक्रोन मिलियन अल्ट्रा हाई मॉलिक्यूलर वेट पॉलीथीन झिल्ली के साथ) रखें।
      3. 96-अच्छी तरह से गहरे ब्लॉक से फिल्टर प्लेट को सील करने के लिए पैराफिल्म में सुझावों को सुरक्षित करने के लिए फिल्टर प्लेट को नीचे पुश करें।
      4. फिल्टर प्लेट के प्रत्येक कुएं में पूर्व-समतुल्य 50% नी-एनटीए राल घोल के 50 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
    2. परीक्षण अभिव्यक्ति प्रक्रिया
      1. 5-10 मिनट के लिए आरटी में पानी के स्नान में 24-अच्छी ब्लॉक में मौजूद जमे हुए सेल निलंबन (चरण 3.1.15) रखें, फिर 20 मिनट के लिए 450 आरपीएम पर हिलाएं।
      2. 15 मिनट के लिए 3,275 x ग्राम पर 24-वेल ब्लॉकों को सेंट्रलाइज करें।
      3. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, क्लीयर किए गए लिसेट को एक फिल्टर प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें 50 माइक्रोन प्री-समतुल्य 50% नी-एनटीए राल घोल (चरण 3.2.1.4) होता है और 96-अच्छी तरह से कैप मैट के साथ फिल्टर प्लेट को सील कर देता है, वर्ग के साथ उपयोग के लिए अच्छी तरह से, 2 एमएलए) ।
        नोट: इनक्यूबेशन और अपकेंद्रित्र चरणों के दौरान बाध्यकारी ब्लॉक को एक साथ रखने के लिए कुछ रबर बैंड का उपयोग करें।
      4. नी-एनटीए राल के साथ मंजूरी दे दी lysates इनक्यूबेट करने के लिए एक ठंडे कमरे में एक रोटेटर में 45-60 मिनट के लिए सुरक्षित बाध्यकारी ब्लॉक रखें ।
      5. इनक्यूबेशन के बाद, ध्यान से फिल्टर प्लेट उठाएं और 96-डीप वेल ब्लॉक (चरण 3.2.1.1) की सतह से पैराफिल्म परत को हटा दें।
      6. 96-डीप वेल ब्लॉक के शीर्ष पर फिल्टर प्लेट वापस रखें और 235 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए सुरक्षित बाध्यकारी ब्लॉक को नीचे स्पिन करें।
      7. वॉश बॉन्ड नी-एनटीए राल 2x के साथ 2 एमएल वॉशिंग बफर जिसमें 25 एमएम ट्रिस पीएच 8.0, 300 mm NaCl, 5% ग्लाइसरोल और 15 एमएम इमिडाजोल शामिल हैं।
      8. अवशिष्ट तरल को पूरी तरह से हटाने सुनिश्चित करने के लिए 235 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए हर बार बफर धोने के साथ ब्लॉक नीचे स्पिन करें।
      9. 4x लोडिंग डाई के 10 माइक्रोन युक्त 96-अच्छी पीसीआर प्लेट के शीर्ष पर फिल्टर प्लेट स्थानांतरित करें।
      10. फिल्टर प्लेट के प्रत्येक कुएं में 40 माइक्रोन एल्यूशन बफर (25 एमएम ट्रिस पीएच 8.0, 300 mM NaCl, 5% ग्लाइसरोल, 500 mm इमिडाजोल) जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      11. 10 मिनट के लिए २३५ एक्स जी पर ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में प्रोटीन को elute करने के लिए ब्लॉक नीचे स्पिन ।
      12. उच्च तापमान प्रतिरोधी नल पैड और 3 मिनट के लिए ९८ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के साथ ९६ अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट सील ।
      13. प्रोटीन सीढ़ी के बगल में 4-20% एसडीएस-पेज जेल पर मानक लैमली बफर में eluted प्रोटीन नमूनों के 15 माइक्रोन लोड करें और एसडीएस युक्त मानक रनिंग बफर के साथ जेल चलाएं।
      14. कूमासी नीले और पानी के साथ डी-दाग के साथ जेल दाग। बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए सबसे अच्छा व्यक्त निर्माण की पहचान करने के लिए परीक्षण अभिव्यक्ति के परिणामों का विश्लेषण करें।

4. प्रोटीन उत्पादन के लिए बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं (एससीबीआईआईसी) की तैयारी

  1. निर्धारित उत्पादन समय से 4 दिन पहले, तेजी से बढ़ रही Sf9 कोशिकाओं को 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल के अंतिम कोशिका घनत्व में १२५ एमएल/२५० एमएल/५०० मीटर में विभाजित करें 1% (v/v) अंतिम एंटीबायोटिक-एंटीमायकोटिक युक्त कीट सीरम-मुक्त माध्यम के 50 एमएल/100 एमएल/200 एमएल में चकरा के साथ Erlenmeyer ग्लास शेक फ्लास्क।
  2. कोशिका प्रभाग को धीमा करने के लिए एक इंच के स्ट्रोक के साथ एक कक्षीय शेखर पर 165 आरपीएम पर 0.150 एमएल / 0.300 एमएल/ 0.6 एमएल जोड़ें।
  3. संक्रमण के बाद 4 दिनों में, एसओआई के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें और उत्पादन के लिए आगे बढ़ें यदि ट्राइपैन ब्लू दाग के साथ सत्यापित सेल व्यवहार्यता 70-75% के करीब है।

5. बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए Sf9 सेल तैयारी

  1. निर्धारित उत्पादन समय से 4 दिन पहले, बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए Sf9 कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा की गणना करें।
  2. कीट सीरम-मुक्त माध्यम में तेजी से बढ़ रही Sf9 कोशिकाओं के बीज 2 एल 2.8 एल फर्नबाख शेक फ्लास्क में 1 x10 6 कोशिकाओं /एमएल के सेल घनत्व के लिए।
  3. 150 आरपीएम पर मिलाते हुए सेट के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट फ्लास्क।
    नोट: Sf9 सेल संस्कृति में जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए, 10 μg/mL या पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन की अंतिम एकाग्रता के लिए क्रमशः ५० यू/एमएल और ५० μg/एमएल, के लिए gentamicin का उपयोग करें ।

6. बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए SCBIIS के साथ Sf9 कोशिकाओं का संक्रमण

  1. 2.5 एल टुनएयर शेक फ्लास्क या 5 एल रिएजेंट बोतलों में 4 x 106 कोशिकाओं/एमएल के अंतिम सेल घनत्व के लिए कीट सीरम-मुक्त माध्यम में तेजी से बढ़ती Sf9 कोशिकाओं के 2 एल या 4 एल विभाजित करें।
  2. बाकुलोवायरस संक्रमित कीट कोशिका (एससीबीआईआईसी) सस्पेंशन कल्चर का 10-12 एमएल/एल जोड़ें ।
  3. 72-96 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस (सेल डिवीजन को धीमा करने के लिए) के निचले तापमान पर 145 आरपीएम के साथ एक शेखर पर Sf9 कोशिकाओं की संक्रमित संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  4. 72 घंटे के बाद संक्रमण, SOI के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच और सेल व्यवहार्यता का आकलन।
  5. आमतौर पर, लगभग 72 एच संक्रमण के बाद, एसएफ 9 कोशिकाओं की व्यवहार्यता 70%-75% तक गिरती है (ट्राइपैन ब्लू दाग का उपयोग करके मापा जाता है)। फसल संक्रमित Sf9 कोशिकाओं को 1 एल पॉलीप्रोपाइलीन बोतल में 900 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा।
  6. 1x पीबीएस के 20-25 एमएल के साथ उत्पादन सेल संस्कृति के 1 एल से एकत्र सेल गोली को धीरे-धीरे घूमता है और 50 मिलीएल शंकु ट्यूबों में स्थानांतरित करके पुनर्निर् हटाना।
  7. 15 मिनट के लिए 900 x ग्राम पर सेल निलंबन को स्पिन करें और पीबीएस समाधान को त्यागें।
  8. सस्पेंशन बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 500 mM NaCl, 5% ग्लाइसरोल, 1x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल) और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज के 20-25 मिलील के साथ धुले हुए सेल पेलेट को फिर से खर्च करें; शुद्धि तक −80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: पीआरएमटीएस के लिए शुद्धि प्रक्रियाओं को एसजीसी प्रकाशित पेपर6में विस्तार से वर्णित किया गया है ।

Representative Results

बीईवीएस प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्र 1में रेखांकित किया गया है । एक अपेक्षाकृत उच्च अभिव्यक्ति स्तर7,9 के साथ घुलनशील और स्थिर प्रोटीन की पहचान करने के लिए सफलता दर बढ़ाने के प्रयास के साथ इन-हाउस रणनीतियों के अनुसार, पूर्ण लंबाई, डोमेन और कटे हुए टुकड़ों सहित पीआरएमटी के कई अभिव्यक्ति निर्माण संरचनात्मक जीनोमिक्स कंसोर्टियम (एसजीसी, टोरंटो) में उत्पन्नहुएथे। इच्छुक पाठकों को एसजीसी की परिभाषाओं और एक अभिव्यक्ति क्लोन में शामिल जीन अनुक्रम के खंड के रूप में "टुकड़ा" डिजाइन करने की पद्धति की समीक्षा करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, "डोमेन" एक पीएफएएम-एनोटेटेड संरचनात्मक डोमेन के रूप में, और अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किए गए टुकड़े के रूप में "निर्माण", जिनमें से सभी को पहले के प्रकाशन7में विस्तार से वर्णित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत पीआरएमटी के अभिव्यक्ति निर्माण पीएफबीओएच-एमएचएल वेक्टर में क्लोन किए गए पॉलीहिस्टिडीन-टैग किए गए प्रोटीन के उत्पादन के लिए हैं, जो पीएफबीओसी1 वेक्टर का व्युत्पन्न है। चित्रा 4में, हम SF9 कोशिकाओं (चरण 3.1.4) में उत्पादन के 4 एमएल के बाद एकत्र छर्रों से PRMT1, 2, 4-9 शुद्ध के अपने टैग घुलनशील निर्माण के एसडीएस-पेज विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं। इस जेल में फुल-लेंथ (FL) PRMT1 और PRMT9 प्रस्तुत नहीं किए गए हैं, क्योंकि FL PRMT1 ई. कोलाईसे उत्पादित किया गया है, और बीईवीएस से उत्पादित FL PRMT9 को फ्लैग-टैग6द्वारा शुद्ध किया गया है। पीआरएमटी1, एफएल पीआरएमटी 4 के कटे हुए निर्माण, और सभी पीआरएमटी 8 निर्माण अपेक्षाकृत उच्च उपज दिखाते हैं, लेकिन प्रोटीन एलुएट्स में सह-शुद्ध संदूषकों के अंश होते हैं। इन निर्माणों को शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इस प्रकार स्केल-अप प्रस्तुतियों से इन प्रोटीनों की शुद्धता में सुधार करने के लिए अतिरिक्त दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है, जैसे कि इनक्यूबेशन के चरण में निकल मोतियों की मात्रा में कमी एक स्पष्ट रूप से lysate के साथ; वॉश बफ़र्स में इमिडाजोल सांद्रता की वृद्धि; तेव प्रोटीज़ के साथ उनके टैग का दरार, इसके बाद नी-एफ़िनिटी राल पर आवेदन किया गया; और, अतिरिक्त शुद्धिकरण कदम जैसे आकार-बहिष्कार और आयन-विनिमय क्रोमेटोग्राफी। PRMT2 के निर्माण एक मजबूत संदूषक बैंड के साथ अन्य प्रोटीन और पूर्ण लंबाई PRMT2 प्रोटीन की तुलना में काफी कम उपज दिखाते हैं। स्केल-अप उत्पादन और आईमैक और आकार-अपवर्जन जैसे शुद्धिकरण के दो चरणों ने एफएल प्रोटीन के लिए सह-शुद्ध संदूषक की लगातार उपस्थिति के साथ-साथ इस निर्माण के लिए कम अभिव्यक्ति स्तर की पुष्टि की। अपने अनिवार्य बाध्यकारी साथी, MEP50 के साथ उत्पादित और शुद्ध PRMT5 परिसर के लिए शुद्ध प्रोटीन प्राप्त किया गया है । पीआरएमटी9 के कटे हुए निर्माण में अन्य पीआरएमटी की तुलना में लगभग दो या तीन गुना कम अभिव्यक्ति स्तर १.५ मिलीग्राम/एल के करीब है । फिर भी, इस निर्माण के पुनः संयोजन वायरल स्टॉक का उपयोग स्केल-अप उत्पादन के लिए किया गया है, डिफ्रेक्टिंग क्रिस्टल प्राप्त किए गए थे, और इस प्रोटीन के लिए संरचना को PRMT4, 6 और 7(चित्रा 5)के साथ हल किया गया था।

स्केल-अप प्रोडक्शंस के लिए, इसी P2 वायरस का उपयोग Sf9 कीट कोशिकाओं की निलंबन संस्कृति को संक्रमित करने के लिए किया गया था। यह कदम सुपरनिटेंट में संक्रमित कोशिकाओं और पी 3 वायरस वाली बाकुलोवायरस-संक्रमित कोशिकाओं की 50/100/200 एमएल उत्पन्न करता है। बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए, एसएफ 9 कोशिकाओं के 2 एल 150 आरपीएम, 27 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 6)पर 2.8 एल फर्नबाख शेक फ्लास्क में से प्रत्येक में सुसंस्कृत थे। उत्पादन के दिन, Sf9 कोशिकाओं के 2 एल (सेल व्यवहार्यता > 97%) 2.5 एल टुनएयर शेक फ्लास्क या 4 एल में 5 एल रिएजेंट बोतलों को 4 x 106/एमएल के सेल घनत्व से पतला किया गया था। ये कोशिकाएं सीधे बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं की निलंबन संस्कृति के 10-12 एमएल/एल से संक्रमित थीं और 145 आरपीएम पर 25 डिग्री सेल्सियस के कम तापमान पर इनक्यूबेटेड थीं। उत्पादन बैच का संक्रमण सीधे बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं की निलंबन संस्कृति के साथ वायरस की मात्रा प्रवर्धन में श्रमसाध्य और समय लेने वाले कदमों को काफी कम कर देता है, संक्रमित कोशिकाओं की अतिरिक्त हैंडलिंग को छोड़कर, और टिटर और वायरस के क्षरण में कमी से बचा जाता है। एक बैच(चित्रा 6)में बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन को अपनाने के लिए उच्च भरने की मात्रा वाले संस्कृति जहाजों में SF9 सेल संस्कृति रखरखाव और स्केल-अप उत्पादन किया गया है।

पूर्ण लंबाई पीआरएमटी 4, 5 (MEP50 के साथ जटिल में), 6, 7, और 9 बाकुलोवायरस मध्यस्थता उत्पादन मंच से उत्पादित प्रोटीन का उपयोग एसजीसी6में गतिज लक्षण वर्णन और अवरोधक यौगिक स्क्रीनिंग के लिए किया गया है। क्रिस्टल संरचनाओं को हल किया गया और प्रोटीन पीआरएमटी 4, 6, 7 और 9 के विभिन्न रासायनिक जांच और अवरोधकों के साथ पूर्ण लंबाई या कटा हुआ रूपों के लिए प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में जमा किया गया था। इन पीआरएमटीएस के लिए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड्स को ऐडजीन प्लाज्मिड रिपॉजिटरी में जमा किया गया था (ऐडजीन एसजीसी, https://www.addgene.org/) का एक वितरण साझेदार है और अनुसंधान समुदाय(चित्रा 5)के लिए उपलब्ध हैं।

Figure 1
चित्रा 1:बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति प्रक्रिया के चरणों का योजनाबद्ध अवलोकन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2:बाकुलोवायरस संक्रमित और असंक्रमित Sf9 कोशिकाओं। संक्रमण के लक्षण कीट कोशिकाओं में संरचनात्मक परिवर्तन हैं, जैसे कोशिका व्यास में 25-50% की वृद्धि, बढ़े हुए कोशिका नाभिक, समान रूप से गोल आकार, प्रसार की हानि, और संस्कृति पकवान सतह का पालन, साथ ही सेल व्यवहार्यता में कमी। व्हाइट स्केल बार 200 माइक्रोन। यहां पेश किए गए संक्रमण के लक्षण ट्रांसफैक्शन रीजेंट्स, जेटप्राइम और एक्स-ट्रेमेजन 9 दोनों का इस्तेमाल करते हुए संक्रमित कोशिकाओं के लिए समान हैं । विशेष उदाहरण दिखाया गया है जेटप्राइम ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के लिए है। (A)एक नियंत्रण के रूप में असंक्रमित Sf9 कोशिकाओं। (ख)बाकुलोवायरस-संक्रमित एसएफ9 कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:परीक्षण अभिव्यक्ति प्रोटीन के त्वरित शुद्धिकरण के लिए बाइंडिंग प्लेट असेंबली। कृपया विवरण के लिए पाठ देखें, चरण 3.2.1-2 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग परिणाम। विभिन्न पीआरएमटी और पीआरएमटी 5-एमईपी 50 परिसर के लिए इसी पी 1 रिकॉम्बिनेंट वायरस से संक्रमित Sf9 निलंबन संस्कृति के 4 एमएल में बैकुलोवायरस मध्यस्थता प्रोटीन उत्पादन के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग परिणाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:संरचनात्मक जीनोमिक्स कंसोर्टियम, टोरंटो (एसजीसी) में क्रिस्टल संरचना अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले PRMT4, 6, 7 और 9 के लिए अभिव्यक्ति का सारांश निर्माण। क्रिस्टल संरचनाओं को हल किया गया और प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में प्रोटीन पीआरएमटी 4, 6, 7 और 9 के विभिन्न रासायनिक जांच और अवरोधकों के साथ पूरी लंबाई या कटा हुआ रूपों के लिए जमा किया गया था। इन पीआरएमटीएस के लिए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड को ऐडजीन प्लाज्मिड रिपॉजिटरी में जमा किया गया था और यह रिसर्च कम्युनिटी के लिए उपलब्ध है (ऐडजीन एसजीसी, https://www.addgene.org/) का एक डिस्ट्रीब्यूशन पार्टनर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:विभिन्न संस्कृति जहाजों में एसएफ9 कीट कोशिका रखरखाव और प्रोटीन उत्पादन: (ए)2.8 एल फर्नबाख फ्लास्क सेल रखरखाव और प्रोटीन उत्पादन के लिए। 72% फिल-वॉल्यूम का उपयोग एक हिलते हुए मंच में थ्रूपुट दर को 2.5 गुना बढ़ाता है। (ख)टुनएयर शेक फ्लास्क (10 में से केवल 9 फ्लास्क इस तस्वीर में प्रस्तुत किए गए हैं) और 80% भरने-वॉल्यूम के साथ रीएजेंट बोतलें झटकों वाले प्लेटफ़ॉर्म की उत्पादन क्षमता में काफी वृद्धि करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

कीट कोशिकाओं में बीईवीएस के फायदों में से एक पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन मशीनरी की क्षमता पर केंद्र होता है ताकि फॉस्फोरिलेशन, माय्रिस्टोइलेशन और ग्लाइकोसिलेशन जैसे अधिक जटिल संशोधनों को सक्षम किया जा सके। स्तनधारी प्रोटीन के अत्यधिक कुशल तह के साथ, ये संशोधन शारीरिक रूप से प्रासंगिक डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए उपयुक्त संशोधित और मुड़ा हुआ प्रोटीन की उच्च मात्रा की सुविधा प्रदान करते हैं16।

यहां, हमने बीईवीएस के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जिसमें पीआरएमटी प्रोटीन के कई निर्माणों की सफल अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण तत्वों पर जोर दिया गया है और बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति मंच में बड़े पैमाने पर पीआरएमटी प्रोटीन उत्पादन: 1) 24 और 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों और बैचमिड डीएनए वायरस के चरणों में जैविक सामग्रियों को स्थानांतरित करने के लिए नियमित, समायोज्य और प्रोग्रामेबल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग रिकॉम्बिनेंट वायरस का संग्रह, रिकॉम्बिनेंट वायरस के वायरल वॉल्यूम का प्रवर्धन और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग ब्लॉक की तैयारी। 2) रिकॉम्बिनेंट वायरस की पीढ़ी के लिए उच्च प्रदर्शन और लागत प्रभावी ट्रांसफैक्शन रिएजेंट। 3) बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं (एससीबीआईआईसी) की निलंबन संस्कृति। 4) बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए Sf9 निलंबन संस्कृति और 2.5 एल टुनएयर शेक फ्लास्क और 5 एल रिएजेंट बोतलों को बनाए रखने के लिए उच्च-भर मात्रा 2.8 एल फर्नबाख शेक फ्लास्क का उपयोग।

परिवर्तन और परिवर्तन के लिए विशेष विचार और तर्क कदम।
यद्यपि एक वाणिज्यिक प्रोटोकॉल एक परिवर्तन 14 के लिए सक्षम कोशिकाओं के100माइक्रोन का उपयोग करने की सिफारिश करता है, वाणिज्यिक DH10Bac ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं की परिवर्तन दक्षता 1 x 108 cfu/μg डीएनए के रूप में उच्च है, इसलिए हम केवल 4 माइक्रोन का उपयोग करते हैं। यह प्रत्येक ट्रांसफॉर्मेंट के लिए बैकमिड डीएनए अलगाव के लिए अलग-थलग सफेद पुनर्संयोजन उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। 24-वेल ट्रांसफैक्शन प्लेट में अनुयायी एसएफ9 कोशिकाओं को सीरम-फ्री कीट मीडिया के 0.5 एमएल में 2 x10 5 /एमएल के सेल घनत्व पर वरीयता दी गई थी। यह मात्रा अच्छी तरह से काम करने की सतह के कवरेज को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है। साथ ही, यह ट्रांसफैक्शन मिश्रण को बहुत अधिक कमजोर नहीं करता है, जो ट्रांसफैक्शन दक्षता को बढ़ाता है। ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स एसएफ9 कोशिकाओं के लिए गैर-विषाक्त हैं, और मीडिया एक्सचेंज आवश्यक नहीं है। मीडिया परिवर्तन के बजाय, सेल विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए 10% (v/v) एफबीएस युक्त मीडिया का एक अतिरिक्त 1.5 एमएल ट्रांसफैक्शन प्लेट में 4-5 घंटे बाद ट्रांसफैक्शन समय में जोड़ा जाता है। दोनों ट्रांसफेक्शन रीएजेंट्स की ट्रांसफेक्शन एफिशिएंसी ज्यादा है। फिर भी, एक्स-ट्रेमेजीन 9 के साथ, संक्रमित कोशिकाओं(चित्रा 2)में संक्रमण के लक्षण जेटप्राइम रिएजेंट की तुलना में 10-12 घंटे पहले दिखाई देते हैं, इसलिए हम प्रोटोकॉल में अगले चरणों के कार्य कार्यक्रम के आधार पर इन अभिकर्मकों के बीच चयन करते हैं, जो समग्र प्रक्रिया में कुछ लचीलापन प्रदान करता है।

प्रोटीन टेस्ट अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग P2 वायरस के साथ स्थापित किया जा सकता है अगर प्रारंभिक recombinant वायरस की मात्रा, ट्रांसफैक्शन प्लेट से एकत्र और P1 के रूप में लेबल, प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए एक सीमित कारक है ।

छोटे से बड़ी संस्कृति की मात्रा में जाने पर विचार।
ऐतिहासिक रूप से, यह माना जाता था कि इष्टतम सेल विकास को एसएफ 9 सेल रखरखाव और स्केल-अप प्रस्तुतियों की निलंबन संस्कृति में एक उच्च वायु स्थान की आवश्यकता होती है। हालांकि, 2014 में, यह बताया गया था कि संस्कृति जहाजों में उच्च वायु क्षेत्र पहले से17सोचा की तुलना में कम महत्वपूर्ण है। एक संस्कृति पोत मिलाते हुए मंच के कक्षीय फेंक करने के लिए उचित समायोजित मिलाते हुए गति का उपयोग कर स्थापित एक लंबे समय के लिए छोटे हवा बुलबुले बनाने और बनाए रखने के द्वारा उच्च भरने मात्रा निलंबन संस्कृति में भी पर्याप्त ऑक्सीजन हस्तांतरण प्रदान करेगा । इस दृष्टिकोण के साथ, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कीट कोशिकाओं को उच्च कोशिका व्यवहार्यता का त्याग किए बिना कोशिकाओं के दोहरीकरण समय की एक सामान्य सीमा के भीतर उच्च झटकों की गति से सुसंस्कृत किया जा सकता है।

इस प्रकार, 6 साल पहले, हमने सेल रखरखाव के दौरान एक मिलाते हुए फ्लास्क में निलंबन संस्कृति की मात्रा बढ़ाना शुरू किया और स्पंदन स्थितियों(चित्रा 6)को समायोजित और निगरानी करते हुए प्रोटीन उत्पादन के लिए एक अलग प्रकार का संस्कृति पोत पेश किया। इन संस्कृति जहाजों में इष्टतम स्थितियों को स्थापित करने के लिए, हमने सेल व्यवहार्यता, आकार और आकार, एकत्रीकरण की स्थिति और कोशिकाओं की संक्रमितता के साथ सेल दोहरीकरण समय जैसे एसएफ9 सेल संस्कृति मापदंडों की निगरानी की।

उदाहरण के लिए, Sf9 सेल रखरखाव के लिए, 2.8 एल फर्नबाख शेक फ्लास्क में, हम 2 एल के बजाय एसएफ9 निलंबन कोशिकाओं के 0.8 एल 27 डिग्री सेल्सियस पर 150 आरपीएम पर मिलाते हुए और सेल व्यवहार्यता 99% के करीब है, समान रूप से आकार के स्वस्थ विभाजन कोशिकाओं के साथ। स्केल-अप उत्पादन के लिए, हम 25 डिग्री सेल्सियस के कम तापमान पर 145 आरपीएम के रूप में उच्च गति से मिलाते हुए 5 एल रिएजेंट बोतलों में 4 एल कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं। बिल्ट-इन झटकों वाले मंच के साथ सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले इनक्यूबेटर 6 x 2.8 एल शेक फ्लास्क या 6 x 5 एल रिएजेंट बोतलें, या 10 x 2.5 एल टुनएयर शेक फ्लास्क पकड़ सकते हैं। इस प्रकार, एक मिलाते हुए मंच की क्षमता, अगर हम फर्नबाख शेक फ्लास्क और रिएजेंट बोतलों को भरने के लिए 1/3 बनाम जहाजों की उच्च भरने की मात्रा के लिए ४.८ एल बनाम 12 एल का उपयोग कर २.८ एल फर्नबाख शेक फ्लास्क और 10 एल बनाम 24 एल 5 एल reagent बोतलों(चित्रा 6)का उपयोग कर । निलंबन सेल संस्कृति रखरखाव और एक उच्च भरने की मात्रा के साथ संस्कृति जहाजों में पैमाने पर उत्पादन हमें उत्पादन की मात्रा की सीमाओं को दूर करने और एक बड़े पैमाने पर मंच अपनाने में मदद मिली है । इस प्रकार, यह प्रयोगशालाओं के लिए अत्यधिक उपयोगी है जिसमें उत्पादन पाइपलाइनों में बायोरिएक्टर और/या सीमित स्थान तक पहुंच नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल को उपयुक्त रेजिन का उपयोग करके और शुद्धिकरण बफ़र्स को संशोधित करके विभिन्न आत्मीयता टैग के साथ प्रोटीन निर्माणों के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है जैसा कि एसजीसी प्रकाशित पेपर6 में PRMT4, 7, 9 के फ्लैग-टैग पूर्ण लंबाई प्रोटीन और उनके टैग किए गए PRMT5-MEP50 जटिल और PRMT6 के लिए वर्णित किया गया है। हालांकि हम प्रोटीन के पीआरएमटी परिवार के लिए एक BEVS प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, एक ही दृष्टिकोण किसी भी अन्य प्रोटीन परिवार के लिए लागू किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि और हमारे सभी एसजीसी सहयोगियों पर मूल्यवान प्रतिक्रिया और महत्वपूर्ण टिप्पणियां प्रदान करने के लिए समय लेने के लिए डालिया Barsyte-Lovejoy का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, जिन्होंने बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर सिस्टम से व्यक्त की गई पीआरएमटी प्रोटीन परिवार के साथ काम किया।

एसजीसी एक पंजीकृत चैरिटी (संख्या 1097737) है जो AbbVie, बायर एजी से धन प्राप्त करता है, बोहरिंगर इंगलहेम, जेनेटेक, जीनोम कनाडा ओंटारियो जीनोमिक्स इंस्टीट्यूट [ओजीआई-196], इनोवेटिव मेडिसिन्स इनिशिएटिव 2 ज्वाइंट अंडरटेकिंग [ईउबोपेन ग्रांट 875510], जानसेन, मर्क केगाए (कनाडा और अमेरिका में उर्फ ईएमडी), फाइजर, लेदा और वेलकम ट्रस्ट [106169/14/Z]।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.8L Nalgene  Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, Nalgene 29171-854 For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells
24-Well Blocks RB Qiagen 19583 For incubation of  4ml of suspension  Sf9 cells  for protein  expression screening
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul Biorad 5671095 For SDS-PAGe analysis of the purified proteins
50ml Reagent Reservoir Celltreat Scientific Products 229290  Reservoir used for diluted transfection reagent  and Sf9 cells suspension
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL Greiner Bio-One 381080 Used to cover 96 well block
96 well PCR plate Eppendorf 30129300
Bacto agar BD 214010 For LB-agar selection paltes
Airpore Tape Sheets Qiagen 19571 To cover 24 well blocks for protein expression screening
Allega X-15R Centrifuge Beckman Coulter 392932
Antibiotic Antimycotic (100x) Gibco 15240112
Bacmid DNA in-house non-catalog item Bacmid DNA for baculovirus production
Bluo-Gal, 1g Thermo Fisher 15519028
Beckman JLA 8.1000
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile Eppendorf 30722116 Tissue  culture treated plate
Cell Resuspension Solution 0.5 L Millipore Sigma LSKCRS500 For Bacmid DNA extraction
Cell Lysis Solution 0.5 L Millipore Sigma LSKCLS500 For Bacmid DNA extraction
CELLSTAR  Tissue Culture Plates, 96 well Greiner Bio-One 655180 For transfection mix
ClipTip 1250, filter reload, sterile ThermoFisher Scientific 94420818 Tips for  programmable and adjustable multichannel pipette
dNTP Mix (25 mM each) Thermo Fisher Scientific R1121
E1-ClipTip  Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL ThermoFisher Scientific 4672090BT Programmable and adjustable multichannel pipette
E4  XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL Ranin LTS EA6-300XLS Ranin adjustable multichannel pipette
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane Agilent 201005-100 For protein purification in expression screening
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L IBI Scientific SS-6003C For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells
Gentamicin 10x10ml BioShop 15750078
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Wisent Biocenter 080-450
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L Wisent Biocenter 301-045-LL Serum free insect cells growth medium
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain Expedeon Protein Solutions ISB1L-1L For protein gel (SDS-PAGE) staining
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% BioShop IPT001.100
JetPRIME Transfection Reagent  Provided with  jetPRIME buffer POLYPLUS TRANSFECTION Inc 114-01 For Sf9 cells transfection to generate baculovirus
Kanamycin Monosulfate BioShop KAN201.100
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& Sigma L3022-1KG
Masterblock 96 deep well 2.4mL Greiner Bio-One 780285-FD Used in the transformation and expression screening procedures
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml Thermo Fisher 10361012 Competent cells for bacmid DNA generation
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL Sartorius Sartorius 725240 12 channel pipette
Neutralization Solution, 0.5 L Millipore Sigma LSKNS0500 For bacmid DNA extraction
New Brunswick  Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) Eppendorf M1282-0004 Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells
Ni-NTA Agarose Qiagen 30250 For protein purification
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco LS15140122
PYREX  Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  500ml Pyrex 4444-500 For  suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  125ml Pyrex 4444-125 For suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  250ml Pyrex 4444-250 For suspension culture of Sf9 cells
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution Froggabio 21141
RNase A, 0.9 mL Millipore Sigma LSKPMRN30 For suspension buffer for bacmid DNA extraction
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads MP Biomedicals 115000550 For  spread  of bacterial  cells across the surface of an agar plate.
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) Ranin 30389253 Tips for ranin multichannel pipette
S.O.C. Medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian cytivalifesciences SH3039602 Addition to the serum free medim for  the transfected cells
Sf9 cells Thermo Fisher 12659017 Insect cells
Sfx-Insect Cell Culture Media Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) SH3027802 Serum free insect cells growth medium
Tape Pad Qiagen 19570 Tape Pad
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units New England Biolabs M0267L
Tetracycline Hcl BioShop TET701.10
Trypan Blue 0.4% Solution Gibco 15250061 For  assessment of cell viability
VITLAB  Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L VITLAB V100889 For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells
VWR  Digital Mini Incubator VWR 10055-006 Incubator for adherent Sf9 cells
VWR  Incubating Microplate Shaker VWR 97043-606 Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks
VWR Petri Dishes VWR CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA  Transfection Reagent  1.0 M Roche 6365787001 For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 173 प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेसेस पीआरएमटीएस बाकुलोवायरस एक्सप्रेशन वेक्टर सिस्टम बीईवीएस स्पोडोप्टेरा फ्रुगिपेरा कीट कोशिकाएं रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन ट्रांसफेक्शन रीएजेंट्स बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं की निलंबन संस्कृति एससीबीआईआईसी 2.8 एल फर्नबाख कल्चर फ्लास्क 2.5 एल लट तुन
बाकुलोवायरस एक्सप्रेशन वेक्टर सिस्टम का उपयोग करके रिकॉम्बिनेंट पीआरएमटी प्रोटीन का उत्पादन
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Hutchinson, A., Seitova, A.… More

Hutchinson, A., Seitova, A. Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System. J. Vis. Exp. (173), e62510, doi:10.3791/62510 (2021).

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