सेल परिपक्वता में सुधार और कठोरता और कारावास के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए 3 डी मिथाइलसेलुलोस आधारित हाइड्रोगेल में मेगाकार्योसाइट संस्कृति
Summary
अब यह स्वीकार किया गया है कि कोशिकाओं का त्रि-आयामी वातावरण उनके व्यवहार, परिपक्वता और/या भेदभाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । यह प्रोटोकॉल मेगाकारियोसाइट्स पर भौतिक रोकथाम और यांत्रिक बाधाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किए गए एक त्रि-आयामी सेल संस्कृति मॉडल का वर्णन करता है।
Abstract
कारावास और यांत्रिक बाधाओं दोनों के लिए अग्रणी 3 डी वातावरण तेजी से सेल व्यवहार के एक महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में पहचाना जाता है । इस प्रकार वीवो की स्थिति में बेहतर दृष्टिकोण के लिए 3 डी संस्कृति विकसित की गई है । मेगाकारियोसाइट्स बोन मैरो (बीएम) में हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) से अंतर करते हैं। बीएम शरीर के सबसे नरम ऊतकों में से एक है, जो हड्डी के अंदर सीमित है। कोशिका पैमाने पर हड्डी खराब उत्तेजित हो रही है, मेगाकारियोसाइट्स एक कमजोर कठोरता और उच्च कारावास के अधीन हैं। यह प्रोटोकॉल इम्यूनो-मैग्नेटिक सॉर्टिंग द्वारा माउस वंश नकारात्मक (लिन-) एचएसपीसीएस की वसूली के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है और मिथाइलसेल्यूलोस से बने 3 डी माध्यम में परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स में उनका भेदभाव करता है। मिथाइलसेल्यूलोस मेगाकैरियोसाइट्स के प्रति अट्रैक्टिव है और इसकी कठोरता को सामान्य अस्थि मज्जा में समायोजित किया जा सकता है या पैथोलॉजिकल फाइब्रोटिक मैरो की नकल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। आगे सेल विश्लेषण के लिए मेगाकारियोसाइट्स को ठीक करने की प्रक्रिया भी प्रोटोकॉल में विस्तृत है। यद्यपि प्रोपलेटर एक्सटेंशन को 3 डी परिवेश के भीतर रोका जाता है, लेकिन इसे नीचे वर्णित किया गया है कि तरल माध्यम में मेगाकरियोसाइट्स को फिर से कैसे रीसस्लपेंड किया जाए और प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करने की उनकी क्षमता की मात्रा निर्धारित की जाए। 3 डी हाइड्रोगेल में उगाए जाने वाले मेगाकारियोसाइट्स में तरल परिवेश में उगाए गए लोगों की तुलना में प्रोपलेटलेट बनाने की क्षमता अधिक होती है। यह 3 डी संस्कृति आई) को एक उच्च परिपक्वता राज्य तक पहुंचने वाले मेगाकार्योसाइट्स की ओर जनकों में अंतर करने की अनुमति देती है, द्वितीय) जो वीवो में मनाया जा सकता है, लेकिन शास्त्रीय तरल संस्कृतियों में किसी का ध्यान नहीं जाता है, और iii) एक 3 डी पर्यावरण द्वारा प्रदान किए गए यांत्रिक संकेतों द्वारा प्रेरित ट्रांसडक्शन रास्ते का अध्ययन करने के लिए।
Introduction
शरीर की कोशिकाएं एक जटिल 3 डी माइक्रोएनवायरमेंट का अनुभव करती हैं और उन्हें रासायनिक और मशीनोभिक संकेतों के बीच परस्पर क्रिया के अधीन किया जाता है जिसमें ऊतक से कठोरता और पड़ोसी कोशिकाओं और आसपास के मैट्रिक्स 1, 2,3के कारण कारावास शामिल है । कठोरता और सेल व्यवहार के लिए कारावास के महत्व को केवल पिछले दशकों में मांयता प्राप्त किया गया है । 2006 में, एंगलर एट अल 4 से मौलिक कार्य ने सेल भेदभाव के लिए यांत्रिक वातावरण के महत्व पर प्रकाश डाला। लेखकों ने दिखा दिया कि सेल सब्सट्रेट कठोरता में भिन्नता के परिणामस्वरूप विभिन्न भेदभाव वंशों की ओर स्टेम कोशिकाओं का अभिविन्यास हुआ। तब से, सेल भाग्य और व्यवहार पर यांत्रिक संकेतों का प्रभाव तेजी से पहचाना और अध्ययन किया गयाहै। बावजूद इसके जीव के नरम ऊतकों में से एक होने के बावजूद, बोन मैरो में एक 3 डी संरचनात्मक संगठन है जो हड्डी के अंदर सीमित है। मैरो कठोरता, हालांकि तकनीकी रूप से ठीक मापने के लिए मुश्किल है, 15 और 300 पीए 5,6केबीच झूठ होने का अनुमान है। स्ट्रोमा के भीतर कोशिकाएं कसकर एक-दूसरे तक सीमित हो जाती हैं। इसके अलावा, उनमें से अधिकांश रक्त परिसंचरण में प्रवेश करने के लिए साइनसॉयड वाहिकाओं की ओर पलायन कर रहे हैं। ये स्थितियां आसन्न कोशिकाओं पर अतिरिक्त यांत्रिक बाधाएं पैदा करती हैं, जिन्हें इन ताकतों के अनुकूल होना पड़ता है । यांत्रिक संकेत एक महत्वपूर्ण पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनके मेगाकार्योसाइट भेदभाव और प्रोपलेटलेट गठन पर परिणाम अभी हाल ही में खोजे गए हैं। यद्यपि मेगाकारियोसाइट्स पारंपरिक तरल संस्कृति में विट्रो में अंतर कर सकते हैं, वे 3 डी पर्यावरण 7से यांत्रिक संकेतों की अनुपस्थिति के कारण वीवो मेंदेखी गई परिपक्वता की डिग्री तक नहीं पहुंचते हैं। हाइड्रोगेल में एम्बेडेड बढ़ते जनक 3डी मैकेनिकल संकेत लाते हैं जिनमें तरल परिवेश की कमी होती है।
हेमेटोपोइटिक प्रोजेनिटर की मात्रा निर्धारित करने के लिए कॉलोनी में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए, विशेष रूप से हेमेटोपोइटिक जनकों को निर्धारित करने के लिए कॉलोनी में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए हाइड्रोगेल का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। हालांकि, इस तरह के हाइड्रोगेल का उपयोग शायद ही कभी 3 डी यांत्रिक वातावरण के परिपक्वता और हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के भेदभाव पर जैविक प्रभाव का पता लगाने के लिए किया गया हो। पिछले कुछ वर्षों में हमारी प्रयोगशाला ने मिथाइलसेल्यूलोस आधारित हाइड्रोजेल 8 का उपयोग करके एक 3डी संस्कृति मॉडल विकसित किया है। यह अट्रैक्टिव फिजिकल जेल देशी मेगाकैरियोसाइट पर्यावरण की शारीरिक बाधाओं की नकल करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। यह मेथोक्साइड समूहों (-ओएच3)द्वारा हाइड्रोक्सिल अवशेषों (-ओह) के प्रतिस्थापन द्वारा सेल्यूलोज से लिया गया है। मिथाइल प्रतिस्थापन और मिथाइलसेलुलोस एकाग्रता की डिग्री दोनों ही एक बार जेलीफाइड होने के बाद हाइड्रोगेल कठोरता निर्धारित करते हैं। इस तकनीक के विकास चरण के दौरान, यह प्रदर्शित किया गया था कि 30 से 60 पीए की सीमा में एक युवा का मॉड्यूलस मेगाकरियोसाइट विकास 9के लिए इष्टतम जेल कठोरता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल 3 डी मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल में माउस मेगाकारियोसाइटिक प्रोजेनिटर विकसित करने की विधि का वर्णन करता है। यह पहले से दिखाया गया है कि मानक तरल संस्कृति की तुलना में, यह हाइड्रोगेल संस्कृति मेगाकार्योसाइट पॉलीप्लाइडाइजेशन की डिग्री बढ़ाती है, परिपक्वता और इंट्रासेलुलर संगठन में सुधार करती है, और एक बार तरल माध्यम 9में पुनर्निर्प्स करने के लिए मेगाकारियोसाइट्स की क्षमता को बढ़ाती है। इस पांडुलिपि में माउस बोन मैरो लिन − कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल और 3 डी संस्कृति के लिए मिथाइलसेल्यूलोस हाइड्रोगेल में उनके एम्बेडिंग के साथ-साथ प्रोपलेट्स का उत्पादन करने की उनकी क्षमता का मात्राकरण और आगे के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की वसूली का विस्तार से वर्णन किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले दशक में, मैकेनोबायोलॉजी ने जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में अधिक से अधिक रुचि बढ़ाई है। अब यह आमतौर पर स्वीकार किया जाता है कि कोशिकाओं के आसपास का यांत्रिक वातावरण उनके व्यवहार में भूमिका निभाता…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक फैबियन पर्टुय और एलिसिया अगुइलर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं जिन्होंने शुरू में प्रयोगशाला में इस तकनीक को विकसित किया था, साथ ही डोमिनिक कॉलिन (इंस्टीटयूट चार्ल्स सड्रॉन – स्ट्रासबर्ग) जो मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल के चिपचिपा गुणों की विशेषता है। इस काम को एआरएमईएसए (एसोसिएशन डी रेचेचे एट डेवेलोपमेंट एन मेडेसिन एट सैंटे पब्लिक) और एआरएन ग्रांट (एएनआर-18-सीई 14-0037 प्लैटफॉरमेचनिक्स) द्वारा समर्थित किया गया था। जूली बोशर प्रियतम डालना ला Recherche Médicale (FRM अनुदान संख्या FDT20201201010422) से एक प्राप्तकर्ता है ।
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
