Culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement
Summary
Il est maintenant reconnu que l’environnement tridimensionnel des cellules peut jouer un rôle important dans leur comportement, leur maturation et/ou leur différenciation. Ce protocole décrit un modèle de culture cellulaire tridimensionnel conçu pour étudier l’impact du confinement physique et des contraintes mécaniques sur les mégacaryocytes.
Abstract
L’environnement 3D conduisant à la fois au confinement et aux contraintes mécaniques est de plus en plus reconnu comme un déterminant important du comportement cellulaire. La culture 3D a ainsi été développée pour mieux aborder la situation in vivo. Les mégacaryocytes se différencient des cellules souches hématopoïétiques et progénitaires (HSPC) dans la moelle osseuse (BM). Le BM est l’un des tissus les plus mous du corps, confiné à l’intérieur de l’os. L’os étant peu extensible à l’échelle cellulaire, les mégacaryocytes sont concomitamment soumis à une faible rigidité et à un confinement élevé. Ce protocole présente une méthode de récupération des HSPC de lignée de souris négative (Lin-) par tri immuno-magnétique et leur différenciation en mégacaryocytes matures dans un milieu 3D composé de méthylcellulose. La méthylcellulose n’est pas réactive envers les mégacaryocytes et sa rigidité peut être ajustée à celle de la moelle osseuse normale ou augmentée pour imiter une moelle fibrotique pathologique. Le processus de récupération des mégacaryocytes pour d’autres analyses cellulaires est également détaillé dans le protocole. Bien que l’extension des proplaquettaires soit empêchée dans le milieu 3D, il est décrit ci-dessous comment remettre en service les mégacaryocytes en milieu liquide et quantifier leur capacité à étendre les proplaquettaires. Les mégacaryocytes cultivés en hydrogel 3D ont une plus grande capacité à former des proplaquettaires que ceux cultivés en milieu liquide. Cette culture 3D permet i) de différencier les progéniteurs vers les mégacaryocytes atteignant un état de maturation plus élevé, ii) de récapituler des phénotypes qui peuvent être observés in vivo mais passent inaperçus dans les cultures liquides classiques, et iii) d’étudier les voies de transduction induites par les signaux mécaniques fournis par un environnement 3D.
Introduction
Les cellules du corps subissent un microenvironnement 3D complexe et sont soumises à l’interaction entre les signaux chimiques et mécanophysiques, y compris la rigidité du tissu et le confinement dû aux cellules voisines et à la matrice environnante 1,2,3. L’importance de la rigidité et du confinement pour le comportement cellulaire n’a été reconnue qu’au cours des dernières décennies. En 2006, les travaux fondateurs d’Engler et al. 4 ont mis en évidence l’importance de l’environnement mécanique pour la différenciation cellulaire. Les auteurs ont démontré que la variation de la rigidité du substrat cellulaire entraînait l’orientation des cellules souches vers diverses lignées de différenciation. Depuis lors, l’impact des signaux mécaniques sur le devenir et le comportement des cellules est devenu de plus en plus reconnu etétudié. Bien qu’elle soit l’un des tissus les plus mous de l’organisme, la moelle osseuse a une organisation structurelle 3D qui est confinée à l’intérieur de l’os. La rigidité de la moelle, bien que techniquement difficile à mesurer avec précision, est estimée entre 15 et 300 Pa 5,6. Dans le stroma, les cellules sont étroitement confinées les unes aux autres. De plus, la plupart d’entre eux migrent vers les vaisseaux sinusoïdaux pour entrer dans la circulation sanguine. Ces conditions créent des contraintes mécaniques supplémentaires sur les cellules adjacentes, qui doivent s’adapter à ces forces. Les indices mécaniques représentent un paramètre important dont les conséquences sur la différenciation des mégacaryocytes et la formation de proplaquettaires ont récemment été explorées. Bien que les mégacaryocytes puissent se différencier in vitro en culture liquide traditionnelle, ils n’atteignent pas le degré de maturation observé in vivo,en partie à cause de l’absence des indices mécaniques de l’environnement 3D 7. La croissance des progéniteurs intégrés dans l’hydrogel apporte des indices mécaniques 3D qui manquent dans le milieu liquide.
Les hydrogels sont largement utilisés depuis plusieurs décennies dans le domaine hématologique, notamment pour faire pousser des cellules dans des essais de formation de colonies afin de quantifier les progéniteurs hématopoïétiques. Cependant, de tels hydrogels ont rarement été utilisés pour explorer l’impact biologique de l’environnement mécanique 3D sur la maturation et la différenciation des cellules hématopoïétiques. Au cours des dernières années, notre laboratoire a développé un modèle de culture 3D utilisant un hydrogel 8à base de méthylcellulose. Ce gel physique non réactif est un outil utile pour imiter les contraintes physiques de l’environnement mégacarytaire natif. Il est dérivé de la cellulose par remplacement des résidus hydroxyles (-OH) par des groupes méthoxyde (-OCH3). Le degré de substitution méthylique et la concentration en méthylcellulose déterminent la rigidité de l’hydrogel une fois qu’il s’est jellifié. Au cours de la phase de développement de cette technique, il a été démontré que le module de Young dans la gamme de 30 à 60 Pa est la rigidité optimale du gel pour la croissance des mégacaryocytes 9.
Le protocole suivant décrit une méthode pour cultiver des progéniteurs mégacaryocytaires de souris dans un hydrogel de méthylcellulose 3D. Il a déjà été démontré que par rapport à la culture liquide standard, cette culture d’hydrogel augmente le degré de polyploïdisation des mégacaryocytes, améliore la maturation et l’organisation intracellulaire, et augmente la capacité des mégacaryocytes à étendre les proplaquettaires une fois ressuspendées dans un milieu liquide 9. Ce manuscrit décrit en détail le protocole d’isolement des cellules Lin− de la moelle osseuse de souris et leur incorporation dans un hydrogel de méthylcellulose pour la culture 3D ainsi que la quantification de leur capacité à produire des proplaquettaires et la récupération des cellules pour des analyses ultérieures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours de la décennie précédente, la mécanobiologie a suscité de plus en plus d’intérêt dans de nombreux domaines de la biologie. Il est maintenant communément admis que l’environnement mécanique entourant les cellules joue un rôle dans leur comportement, soulignant l’importance d’étudier comment les mégacaryocytes détectent et réagissent aux signaux mécaniques extracellulaires. Il est difficile de mesurer avec précision la rigidité du tissu de la moelle osseuse in situ<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Fabien Pertuy et Alicia Aguilar qui ont initialement développé cette technique en laboratoire, ainsi que Dominique Collin (Institut Charles Sadron – Strasbourg) qui a caractérisé les propriétés viscoélastiques de l’hydrogel de méthylcellulose. Ce travail a été soutenu par l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) et par une subvention ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher est récipiendaire de la Fondation pour la Recherche Médicale (frM numéro FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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