在3D甲基纤维素基水凝胶中培养巨核细胞，以改善细胞成熟并研究僵硬和禁闭的影响
Summary
现在人们承认，细胞的三维环境可以在它们的行为，成熟和/或分化中发挥重要作用。该协议描述了一个三维细胞培养模型，旨在研究物理遏制和机械约束对巨核细胞的影响。
Abstract
导致限制和机械约束的3D环境越来越被认为是细胞行为的重要决定因素。因此，3D培养已被开发出来，以更好地处理 体内 情况。巨核细胞与骨髓中的造血干和祖细胞（HSPCs）（BM）分化。BM是身体最柔软的组织之一，局限于骨骼内。骨骼在细胞尺度上伸展性差，巨核细胞同时受到弱僵硬和高限制。该协议提出了一种通过免疫磁性分选回收小鼠谱系阴性（Lin-）HSPCs的方法，并在由甲基纤维素组成的3D培养基中将其分化为成熟的巨核细胞。甲基纤维素对巨核细胞无反应，其硬度可调整至正常骨髓的硬度或增加以模仿病理性纤维化骨髓。方案中还详细介绍了回收巨核细胞以进行进一步细胞分析的过程。虽然在3D环境中阻止了丙酸盐的延伸，但下面描述了如何在液体培养基中重悬巨核细胞并量化它们延伸丙酸盐的能力。与在液体环境中生长的巨核细胞相比，在3D水凝胶中生长的巨核细胞具有更高的形成丙酸盐的能力。这种3D培养允许i）区分祖细胞，使其达到更高的成熟状态，ii）概括可能在体内观察到但在经典液体培养 物中 未被注意的表型，以及iii）研究由3D环境提供的机械线索诱导的转导途径。
Introduction
体内的细胞经历复杂的3D微环境，并受到化学和机械生理线索之间的相互作用，包括组织的僵硬和由于邻近细胞和周围基质1，2，3而导致的限制。 僵硬和限制对细胞行为的重要性直到最近几十年才得到认可。2006年，Engler等人4的开创性工作强调了机械环境对细胞分化的重要性。作者证明，细胞底物刚度的变异导致干细胞朝向各种分化谱系的方向。从那时起，机械线索对细胞命运和行为的影响越来越得到认可和研究。尽管它是生物体中最柔软的组织之一，但骨髓具有限制在骨骼内的3D结构组织。骨髓刚度虽然在技术上难以精确测量，但估计在15和300 Pa 5，6之间。在基质中，细胞彼此紧密地限制。此外，它们中的大多数正在向正弦血管迁移以进入血液循环。这些条件对相邻单元产生了额外的机械约束，这些单元必须适应这些力。机械线索代表了一个重要的参数，其对巨核细胞分化和丙酸盐形成的影响最近刚刚被探索出来。尽管巨核细胞可以在体外区分传统的液体培养物，但它们没有达到在体内观察到的成熟度，部分原因是缺乏来自3D环境的机械线索7。嵌入水凝胶中的不断增长的祖细胞带来了液体环境中缺乏的3D机械线索。
水凝胶在血液学领域已被广泛使用了几十年，特别是在集落形成测定中生长细胞以量化造血祖细胞。然而，这种水凝胶很少用于探索3D机械环境对造血细胞成熟和分化的生物学影响。在过去的几年中，我们的实验室使用基于甲基纤维素的水凝胶 8开发了3D培养模型。这种非反应性物理凝胶是模拟天然巨核细胞环境的物理约束的有用工具。它通过用甲醇基团（-OCH3）取代羟基残基（-OH）从纤维素中提取。甲基取代度和甲基纤维素浓度决定了水凝胶在果冻后的刚度。在该技术的开发阶段，证明30至60 Pa范围内的杨氏模量是巨核细胞生长的最佳凝胶刚度 9。
以下方案描述了在3D甲基纤维素水凝胶中培养小鼠巨核细胞祖体的方法。先前已经表明，与标准液体培养物相比，该水凝胶培养物增加了巨核细胞多倍化的程度，改善了成熟和细胞内组织，并增加了巨核细胞在液体培养基中重悬后延长丙酸盐的能力 9。本手稿详细描述了分离小鼠骨髓Lin−细胞的方案，并将其嵌入甲基纤维素水凝胶中进行3D培养，以及量化其产生丙烯酸盐的能力和回收细胞以进行进一步分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
在过去的十年中，机械生物学在生物学的许多领域引起了越来越多的兴趣。现在人们普遍认为，细胞周围的机械环境确实在其行为中起作用，强调了研究巨核细胞如何感知和响应细胞外机械线索的重要性。在 原位11准确测量骨髓组织的硬度是具有挑战性的，特别是如果我们考虑造血红骨髓，因为它位于大型哺乳动物的小梁骨内，而从骨骺中更容易获得的骨髓主要由脂肪细?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢Fabien Pertuy和Alicia Aguilar，他们最初在实验室中开发了这项技术，以及Dominique Collin（Institut Charles Sadron – Strasbourg），他描述了甲基纤维素水凝胶的粘弹性特性。这项工作得到了ARMESA（医学和公共发展协会）和ARN赠款（ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics）的支持。Julie Boscher是医学研究基金会（FRM拨款编号FDT202012010422）的获奖者。
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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