細胞成熟を改善し、剛性と閉じ込めの影響を研究する3Dメチルセルロース系ヒドロゲルにおける巨核球培養
Summary
細胞の立体環境は、その行動、成熟および/または分化において重要な役割を果たすことができることが認められています。このプロトコルは、巨大核球に対する物理的な封じ込めおよび機械的制約の影響を研究するために設計された3次元細胞培養モデルを記述する。
Abstract
閉じ込めと機械的な制約の両方につながる3D環境は、細胞の挙動の重要な決定要因としてますます認識されています。3D培養は、 インビボ の状況によりよく近づくために開発されました。巨核球は骨髄(BM)における造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)と区別する。BMは、骨の中に閉じ込められた身体の最も柔らかい組織の一つです。骨は細胞スケールで十分に拡張できないが、巨核球は弱い剛性と高い閉じ込めを受ける。このプロトコルは、メチルセルロースからなる3D培地における免疫磁気選別と成熟した巨核球への分化によるマウス系分(Lin-)HSPCsの回復方法を提示する。メチルセルロースは巨核球に対して非反応性であり、その剛性は正常な骨髄のそれに調節されるか、または病理学的線維性骨髄を模倣するように増加することができる。さらなる細胞分析のために巨核球を回収するプロセスもプロトコルで詳述されている。プロ血小板の伸長は3Dミリュー内で防止されるが、メガ核球を液体培地で再懸濁し、プロ血小板を拡張する能力を定量化する方法を以下に説明する。3Dヒドロゲルで成長した巨核球は、液体ミリューで増殖したものに比べてプロ血小板を形成する能力が高い。この3D培養により、i)より高い成熟状態に達する巨核球に対する前駆細胞を区別することができ、ii) 生体内で 観察されるかもしれないが古典的な液体培養では気付かれないフェノタイプを再現し、iii)3D環境によって提供される機械的手がかりによって誘発される伝達経路を研究する。
Introduction
体内の細胞は複雑な3D微小環境を経験し、隣接する細胞および周囲のマトリックス1、2、3による組織からの剛性および閉じ込めを含む化学的およびメカノ物理的手掛かりとの相互作用を受ける。細胞行動の剛性と閉じ込めの重要性は、過去数十年でしか認識されていません。2006年、Englerら4の精力的な研究は、細胞分化のための機械的環境の重要性を強調した。その結果、細胞基質剛性のばらつきが、幹細胞の様々な分化系統に向かう方向を生じることを実証した。それ以来、機械的手掛かりが細胞の運命や行動に与える影響はますます認識され、研究されるようになった。それは生物の最も柔らかい組織の一つであるにもかかわらず、骨髄は骨の中に閉じ込められている3D構造組織を有する。骨髄の剛性は、技術的には正確に測定することは困難であるが、15と300 Pa5、6の間にあると推定される。間質の中で、細胞は互いにしっかりと閉じ込められている。さらに、それらのほとんどは血液循環に入るために、シヌサイド血管に向かって移動しています。これらの条件は、隣接する細胞に追加の機械的拘束を作成します, これらの力に適応する必要があります.機械的手掛かりは、巨核球分化とプロ血小板形成に対する結果が最近検討された重要なパラメータを表しています。巨核球は従来の液体培養においてインビトロで分化することができるが、それらは3D環境7からの機械的手掛かりがないこともあって、生体内で観察される成熟度に達しない。ヒドロゲルに埋め込まれた前駆物質の成長は液体ミリューに欠けている3Dの機械の手掛かりをもたらす。
ヒドロゲルは、造血前駆物質を定量化するアッセイを形成するコロニーで細胞を成長させるために、特に、血球学的分野で数十年にわたって広く使用されてきました。しかし、このようなヒドロゲルは、造血細胞の成熟および分化に対する3D機械的環境の生物学的影響を探求するためにほとんど使用されていない。ここ数年、私たちの研究室はメチルセルロースベースのヒドロゲル 8を用いた3D培養モデルを開発しました。この非反応性物理ゲルは、天然の巨核球環境の物理的制約を模倣するのに有用なツールです。これは、メトキシド基(-OCH3)によるヒドロキシル残基(-OH)の置換によりセルロースに由来する。メチル置換の程度とメチルセルロース濃度の両方が、一度ジェリ化したヒドロゲル剛性を決定します。この技術の開発段階において、30~60 Paの範囲のヤング率が、巨核球増殖に最適なゲル剛性 である9を実証した。
以下のプロトコルは、3Dメチルセルロースヒドロゲル中でマウス巨核細胞性前駆物質を成長させる方法を説明する。従来、標準的な液体培養物と比較して、このヒドロゲル培養は巨核球の多倍化の程度を増加させ、成熟および細胞内組織を改善し、そして、液体培地 9に再懸濁されたプロ血小板を拡張する巨核球の能力を増加させることが示されている。本稿では、マウス骨髄Lin-細胞の単離プロトコルと3D培養用メチルセルロースヒドロゲルへの埋め込み、プロ血小板を産生する能力の定量化、さらなる分析のための細胞回収について詳細に説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去10年間で、メカノバイオロジーは生物学の多くの分野でますます関心を集めています。細胞を取り巻く機械的環境が行動に役割を果たしていることが一般的に認められ、巨核球が細胞外の機械的手がかりをどのように感知し、反応するかを研究することの重要性を強調しています。特に大型哺乳類の骨骨の中に位置する造血用赤い骨髄を考慮すると、糖尿病からより容?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、最初に実験室でこの技術を開発したファビアン・ペルトゥイとアリシア・アギラール、ならびにメチルセルロースヒドロゲルの粘弾性特性を特徴づけたドミニク・コリン(チャールズ・サドロン研究所 – ストラスブール)に感謝したいと考えています。この作品は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)とARN助成金(ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics)によって支えられました。ジュリー・ボッシャーは、フォンダシオンの受賞者で、レシェルシュ・メディカル(FRM助成金番号FDT202012010422)を注ぎます。
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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