Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור של דיו ביו-חומרים אגרוז משובץ ננו-תאית לגבישית

Published: May 11, 2021 doi: 10.3791/62519
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Nanotechnology Research Center, National Research Council Canada, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

Summary

פרוטוקול זה מדגיש שיטה להערכה מהירה של תאימות ביולוגית של ננו-תאי גבישי (CNC)/אגרוז דיו ביו-חומרים מרוכבים הידרוג'ל עם תאי פין שמקורם במח העצם של העכבר במונחים של כדאיות התא וביטוי פנוטיפי של קולטני פני השטח של התא, קיט (CD117) וקולטן IgE בעל זיקה גבוהה (FcεRI).

Abstract

ביו-הדפסה תלת מימדית (תלת-ממדית) משתמשת ברכיבים מרוכבים מבוססי הידרוג'ל (או דיו ביו-חומרי) המופקדים בתבנית ויוצרת מצע שעליו מופקדים תאים. מכיוון שדיו ביו-חומרים רבים יכולים להיות ציטוקסיים פוטנציאליים לתאים ראשוניים, יש צורך לקבוע את תאימות ביולוגית של מרוכבים הידרוג'ל אלה לפני השימוש שלהם בתהליכים יקרים של הנדסת רקמות תלת-ממדיות. כמה שיטות תרבית תלת-ממדית, כולל הדפסה ביולוגית, דורשות שתאים יוטבעו במטריצה תלת-ממדית, מה שמקשה על חילוץ וניתוח התאים לשינויים בכדאיות ובביטוי סמן ביולוגי מבלי לגרום לנזק מכני. פרוטוקול זה מתאר כהוכחה של מושג, שיטה להערכת תאימות ביולוגית של ננו-תאי גבישי (CNC) מוטבע אגרוז מרוכבים, מפוברק לתוך מערכת תרבית 24-well, עם תאי פיטום נגזר מח עצם העכבר (BMMCs) באמצעות תרסיסים ציטומטריים זרימה עבור הכדאיות התא וביטוי סמן ביולוגי.

לאחר 18 שעות של חשיפה למטריקס CNC / אגרוז / D-מניטול, הכדאיות BMMC לא היה ללא כל כפי שנמדד על ידי חמיצות יוד פרופיליום (PI). עם זאת, BMMCs תרבית על CNC / agarose / D-מניטול מצע נראה להגדיל מעט את הביטוי שלהם של קולטן IgE זיקה גבוהה (FcεRI) ואת קולטן גורם תא גזע (ערכה; CD117), למרות שזה לא נראה תלוי בכמות CNC בביוינק מורכב. הכדאיות של BMMCs הוערכה גם בעקבות חשיפה לקורס זמן לפיגומים הידרוג'ל שהיו מפוברקים מדיו ביו-חומרים מסחרי המורכב מננו-תאי פרברילר (FNC) ונתרן אלגינט באמצעות ביו-הדפסה תלת-ממדית. במשך תקופה של 6-48 שעות, מצעים FNC / אלגינט לא השפיעו לרעה על הכדאיות של BMMCs כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה ובדיקות microtiter (XTT ו לקטט דהידרוגנאז). פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לסנן במהירות את התאימות הביוכימית של דיו ביו-חומרים מועמד עבור השירות שלהם כפיגומים תלת-ממדיים לזריעה לאחר ההדפסה עם תאי פין.

Introduction

העניין האחרון במערכות תרבות תלת-ממדית וביו-הדפסה תלת-ממדית מיקד את תשומת הלב בהידרוג'לים ובהידרוג'ל מרוכבים. מרוכבים אלה משמשים צמיג אך נקבובי biomimetics והוא יכול להיות מורכב עד 99% תכולת מים לפי משקל, אשר דומה רקמות ביולוגיות1,2,3. תכונות אלה של מרוכבים הידרוג'ל ובכך לאפשר את הצמיחה של תאים מבלי להשפיע על הכדאיות שלהם ותפקוד. מרוכבים אחד כזה הוא ננו-תאי גבישי (CNC), אשר שימש כחומר חיזוק ב מרוכבים הידרוג'ל, פיגומים תאים בפיתוח של שתלים ביו-חומרים, ובתרבות תאים דו מימדית (2D) ותלת-ממדית במבחנה4,5. על פי רוב, מטריצות המורכבות CNC אינן ציטוטוקסיות גלויות לתאי אפיתל קרנית אנושית6, תאי אפיתל מעיים7, תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם האנושי8, או תאים דמויי נוירון9. עם זאת, פעילות מטבולית והתפשטות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם האנושיים פוחתת בקורלציה עם הצמיגות המוגברת של מרוכבים ננו-תאיים מבוססי עץ, דבר המצביע על כך שיש לבדוק בקפידה את הרכב המטריצה להשפעותיה המזיקות על תפקודי התא8.

באופן דומה, CNC יכול לגרום לתגובות דלקתיות במקרואפגים עם ההפנמה, אשר יכול להיות השלכות חמורות במערכות תרבית תאי החיסון 3D10,11. למעשה, יש מעט מאוד נתונים זמינים על איך CNC עשוי להשפיע על תגובות אחרות של תאי החיסון, במיוחד תגובות דלקתיות אלרגיות כי הם יזם על ידי תאי פין. תאי פיסט הם לויקוציטים מגורענים המבטאים את קולטן IgE בעל הזיקה הגבוהה, FceRI, האחראי להפעלת תגובות דלקתיות לאלרגנים. התפשטותם ובידולם תלויים בגורם תאי הגזע (SCF), הקושר את קולטן טירוזין, קיט. תאי פיסט נגזרים מתאי מח עצם שנכנסים למחזור ולאחר מכן נודדים באופן היקפי כדי להתפזר בכל מקום בכל הרקמות האנושיות12. כמו תאי פין לתפקד בסביבת רקמה 3D, הם מועמד אידיאלי לתאי החיסון לחקר תהליכים אימונולוגיים במודלים של רקמת 3D במבחנה. עם זאת, עד כה, אין מודל רקמה 3D במבחנה המכיל תאי פין.

בשל האופי הרגיש ביותר של תאי פיסט ונטייתם לעורר תגובות פרו דלקתיות לגירויים חיצוניים, נדרשת התחשבות זהירה במרכיבי מטריצת תלת-ממד ושיטת ההדפסה הביולוגית של החדרת תאי פיסט לפיגומים תלת-ממדיים, כפי שנדון בהמשך. מבנים רקמה יכול להיות biofabricated משתי קטגוריות רחבות של biomaterials, כלומר, bioinks ודיו ביו-חומרים. ההבחנה טמונה בעובדה כי bioinks הם מרוכבים הידרוג'ל עמוס תאים, ואילו דיו ביו-חומרים הם מרוכבים הידרוג'ל כי הם נטולי תאים, כפי שהוגדר על ידי Groll et al.13,14. לפיכך, מבנים תלת-ממדיים המודפסים עם ביו-ינקים מכילים תאים המוטבעים מראש במטריצת ההידרוג'ל, בעוד מבנים תלת-ממדיים המודפסים בדיו ביו-חומריים צריכים להיות מוזרעים בתאים לאחר ההדפסה. הביו-פיכחון של פיגומי תרבות מביו-ינקים/דיו ביו-חומרי מבוססי הידרוג'ל מבוצע בדרך כלל באמצעות ביו-הדפסה תלת-ממדית של שחול, המבלטים בדיו הביו-וינק/ביו-חומרים באמצעות זרבובית מיקרו-קשקשים תחת לחץ באמצעות בוכנה פנאומטית או מכנית14. ביו-הדפסה מייצרת פיגומים תלת-ממדיים על ידי הפקדת הביו-ינק בדפוסים חתך בדו-ממדיים שנערמו זה על זה בגישה של "מלמטה למעלה".

כדי להיות תואם להדפסה ביולוגית של שחול, הדיו הביולוגי/ביו-חומרים מבוסס ההידרוג'ל חייב להיות בעל תכונות טיקסוטרופיות (דילול גחלה), לפיהן פולימרים הידרוג'ל המרכיבים את זרימת הדיו הביו-וינק/ביו-חומרים כמו נוזל דרך זרבובית מיקרו-ערוצית כאשר הם נתונים ללחץ גזוז, אך חוזרים למצב צמיג דמוי ג'ל עם הסרת הלחץ הגועתי15 . בשל תכולת המים הגבוהה שלהם, יש לקשר בין הפולימרים של ביונקים ביולוגיים/דיו ביו-חומרי מבוססי הידרוג'ל, פיזית או קוולנטית, כדי לשמור על הארכיטקטורה והשלמות המבנית של המבנה הביו-מודפס תלת-ממדי. במקרה של ביונקים עמוסי תאים, התאים נתונים ישירות ללחצים כימיים במהלך תהליך ההצלבה. תהליך השולט תאים עטופים בתוך מטריצת הידרוג'ל bioink גם נושא את התאים לגיז לחץ גיזום, אשר יכול להוביל ירידה הכדאיות ו /או מוות תאים. לאחר מודל הרקמה 3D כבר ביוהדפסה, קשה להפלות בין רמות של ציטוטוקסיות המועלה על ידי מטריצת הידרוג'ל עצמה ואת תהליכי שחול וקישור, בהתאמה. זה מאתגר במיוחד בהקשר של פיגומים תלת-ממדיים שבהם התאים מוטבעים מראש בתוך מטריצת ההידרוג'ל, ובכך מקשים על הסרת התאים עבור ניתוחים הבאים, אשר יפגע בכדאיות של תאי פין.

גישה עדינה יותר ליצירת מבנים של רקמה תלת-ממדית המכילה תאי פיסט כרוכה בזריעת התאים לפיגומים תלת-ממדיים דיו ביו-חומריים מודפסים מראש מהשעיית תרבית התא, הממנפת את היכולת המולדת של תאי פין לנדוד מהמחזור לרקמות היקפיות. היתרונות של גישת זריעת תאים זו הם כפולים: (i) תאי התורן אינם נתונים לגיזום גיזה וכימיקלים מתהליכי השחול וההצלבה, בהתאמה, ו-(ii) ניתן להסיר בקלות את התאים מהפיגומים 3D לאחר החשיפה על ידי כביסה עדינה לניתוח מבלי להשפיע לרעה על הכדאיות שלהם. היתרון הנוסף של זריעה וניתוח הכדאיות של תאי פיסט על פיגומי הידרוג'ל נקבוביים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית לעומת דיסקים הידרוג'ל דו-ממדיים הוא שפיגומי הידרוג'ל תלת-ממדיים מודפסים ביו-הדפסה חוזרים לתכונות טופוגרפיות מיקרו-בקנה מידה זעיר של רקמות ויוו , שאינן קיימות בתפזורת, דיסקים הידרוג'ל פלנאריים דו-ממדיים. גישה זו היא גישה מתאימה, מהירה וחסכונית כדי לקבוע את ההשפעות הציטוטוקסיות שעלולות להיות קטסטרופליות של מטריצות הידרוג'ל ביו-סינק מועמדות על תאי פיטום, כמו גם תאים אימונולוגיים אחרים, לפני השקעה בניסויים יקרים בהנדסת רקמות תלת-ממדיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מורכב מחמישה חלקים: (1) בידוד של מח עצם העכבר ובידול של תאי פיטום שמקורם במח עכבר (BMMCs), (2) ייצור של מצעים הידרוג'ל CNC / agarose / D-מניטול במערכת 24-well ותרבות של BMMCs על המצעים, (3) הסרת BMMCs מן CNC / agarose / D-מניטול הידרוג'ל וסטוח של כדאיות וביטוי סמן ביולוגי באמצעות cytometry זרימה, (4) ביו-הדפסה תלת-ממדית של פיגומי הידרוג'ל מפיברילר ננו-תאי (FNC) /נתרן אלגינט ביו-חומרים מורכבים, ותרבית (5) של BMMCs על פיגומי הידרוג'ל FNC/נתרן אלגינט וניתוח הכדאיות באמצעות ציטומטריית זרימה, XTT, ומיקרו-טייטר דהידרוגנאז לקטט (LDH).

1. דור תרבות ה- BMMC

הערה: עכברים הומתו על ידי חנק CO2 בעקבות הרדמה איזופלורן. השוקה ועצם הירך היו מבודדים, ומח עצם שלם נקצר. כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם למועצה הקנדית להנחיות ולמדיניות לטיפול בבעלי חיים באישור ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים במדעי הבריאות של אוניברסיטת אלברטה.

  1. הכן את RPMI-1640 מלא תרבות בינוני על ידי הוספת התוספים המפורטים בטבלה 1 לריכוזים הסופיים שצוינו. כוונן את רמת ה-pH של המדיום ל-7.4-7.6 באמצעות NaOH, עיקור מסנן באמצעות מסנן חד פעמי עם בקבוק עליון (גודל נקבובית של 0.2 מיקרומטר) ואחסן ב-4 °C (4 °F) בחושך למשך עד חודשיים.
  2. להשיג ירמואים מעכברים בהתאם לפרוטוקולים והנהלים של הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטה.
    הערה: במחקר זה, עצם הירך היו מבודדים מעכברים C57BL/6, אבל כל זן יכול לשמש אם זה רלוונטי למחקר.
  3. בעזרת מספריים, הסירו את העור והשרירים ממפרק הירך ולאחר מכן משכו בעדינות את עצם הירך על-ידי פיתול מעט מתוך שקע הירך (איור 1). תיזהר לא לשבור את ראש הירך. חותכים את השוקה הרחק מ עצם הירך ב-1.5 מעלות באמצעות מספריים. הסר את כף רגל על ידי חיתוך ממש מעל הקלקנום ולהשליך.
  4. בעזרת אזמל, יש להסיר את העור ואת הסחוס מחתיכות עצם הירך והשוקה. באמצעות מספריים, לעשות חתך נקי על כל קצה של עצם הירך ואת השוקה, לחשוף את מח העצם האדום בפנים. במידת הצורך, להסיר את השוקית בשלב זה, אבל שים לב שזה עשוי לסייע במניפולציה של השוקה במהלך שטיפה מח עצם.
  5. הכן מחט 26 G עם מזרק 5 מ"ל luer-lock, ולמלא עם כ 5 מ"ל של מדיה מלאה מוכן כמתואר לעיל.
    הערה: בשלב זה, RPMI לא שלם ללא התוספים יכול לשמש גם כדי לחסוך על ריאגנטים.
  6. מחזיק את עצם הירך או השוקה עם מלקחיים, להכניס את המחט לקצה אחד של העצם ולחץ בעדינות על המזרק. החזק את העצם מעל צינור חרוט סטרילי 50 מ"ל, בעדינות להזריק כ 5 מ"ל של בינוני לתוך העצם, הפעלת קצת לחץ. צפו בפיסות של מח עצם נופלות מהקצה השני של העצם כסרטים אדומים דקים לתוך הצינור החרוט.
  7. ספין למטה את השאיפות resuspend במדיום מלא, או להעביר ישירות לתוך T175 cm2 בקבוק תרבית רקמות סטריליות המכיל 50 מ"ל של RPMI-1640 מלא בינוני. שמור על השאיפות במדיום RPMI-1640 מלא עם 30 ng/mL עכבר רקומביננטי interleukin (IL)-3.
  8. לאחר יום אחד, התבונן בתרביות תחת מיקרוסקופ אור. התרבות תורכב מאוכלוסייה הטרוגנית של תאים בצורות וגדלים שונים וחתיכות גדולות עוד יותר של מח עצם. הזן תרביות תאים על ידי הוספת 15 מ"ל של מדיום טרי כל 3-5 ימים באמצעות המדיום המלא RPMI-1640 כמתואר לעיל, ולהבטיח את צפיפות התא לעולם לא יעלה על 1 × 106 תאים / מ"ל. פעם בשבוע, לסובב את התאים ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, resuspend טרי RPMI-1640 בינוני, לפצל 1:4 לתוך 50 מ"ל של בינוני בבקבוקי T175 טריים.
  9. לאחר 4 שבועות, לקבוע את טוהר התא על ידי מדידת ביטוי פני השטח של קולטני CD117 (Kit) ו- FceRI על ידי ציטומטריית זרימה כמתואר להלן (סעיף 3.2).
    הערה: לאחר 4 שבועות, 99% מהתאים צריכים להיות חיוביים כפולים עבור CD117 (Kit) ו- FcεRI.
  10. ב 4 שבועות ואילך, לשמור על BMMCs עם 20 ננוגרם / מ"ל של IL-3 במצב בינוני RPMI-1640 מלא. בעוד כ-6 שבועות, התאים יפסיקו להתחלק ולא יזדקקו עוד לפיצול. להאכיל את התרבויות כל 3-5 ימים, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה פעם בשבוע, ו resuspend RPMI-1640 מלא טרי.

2. ייצור המצעים ההידרוגלים CNC/אגרוז/D-מניטול ותרבות ה- BMMC

  1. בבקבוק זכוכית, להוסיף 0.2 גרם של אבקת אגרוז מלוחים חוצצי פוספט (PBS) (2% w /v) לנפח סופי של 10 מ"ל, להרתיח במשך 1 דקות ב 100 °C (50 °F) כדי להתמוסס.
  2. יש להמיס 2.5 גרם אבקת CNC ב-PBS לנפח סופי של 10 מ"ל כדי להכין תערובת של 25% w/v.
  3. ממיסים 2 גרם אבקת CNC ב- PBS לנפח סופי של 10 מ"ל כדי להכין תערובת של 20% w/v, ולדלל באופן סדרתי את תערובת 20% w/v כדי להכין תערובות 10, 5 ו-2% w/v CNC.
  4. מחממים את התערובות 25, 20, 10, 5 ו-2% w/v CNC ל-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (איור 2A).
  5. הוסיפו 0.46 גרם של D-מניטול לתמיסת אגרוז חם (4.6% w/v) והתמוססו.
  6. מערבבים את תערובות 25, 20, 10, 5 ו-2% w/v CNC-PBS עם תמיסת האגרוז/D-מניטול החמה בצינורות חרוטיים נפרדים ביחס של 1:1 כדי להניב ריכוזי CNC סופיים של 12.5, 10, 5, 2.5 ו-1% w/v בתערובות ההידרוגל.
  7. כדי לעבוד במהירות, להוסיף 500 μL/well של הפתרונות הנ"ל שהוכנו בשלב 2.6 ב-quadruplicate ללוח תרבות של 24 בארות, ולתת לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להקל על פילמור (איור 2B).
  8. שכבה בזהירות 1000 μL של השעיית BMMC בצפיפות של 1.1 × 106 תאים / מ"ל על גבי מצעים הידרוג'ל עם micropipettor, ולהימנע מלגעת בג'ל עם קצה הפיפטה כמו זה יפגע פני השטח ג'ל וליצור חלקיקים.
  9. לדגור את BMMCs על מצע הידרוג'ל באינקובטור סטרילי (5% CO2, אטמוספרה לחה) ב 37 °C (18 שעות).

3. ניתוחים ציטומטריים זרימה

  1. ניתוח ציטומטרי זרימה של הכדאיות BMMC באמצעות אי הכללת PI
    1. הסר בזהירות את המדיום התרבותי המכיל BMMCs מראש CNC / אגרוז / D-מניטול, הימנעות הג'ל, ולהעביר את התאים לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל.
    2. לשטוף את BMMCs פעמיים עם PBS (pH 7.4) המכיל 0.5% w / v אלבומין סרום בקר ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ו resuspend ב 180 μL של PBS-0.5% w /v BSA לצפיפות סופית של 1.5 × 106 תאים / מ"ל. מעבירים את התאים לצלחת עגולה 96 היטב.
      הערה: מסנן-לעקר את כל פתרונות PBS-0.5% w /v BSA פעמיים באמצעות מסנן מזרק בגודל 0.2 מיקרומטר, ולאחסן ב 4 °C (7 °F).
    3. הוסף 20 μL של PBS-0.5% w /v BSA, או 10x PI (100 מיקרוגרם / מ"ל) מוכן PBS-0.5% w / v BSA, לתאים לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל, ודגרה עבור 1 שעות ב 4 °C (5 °F) או 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לרכוש נתוני פלואורסצנטיות באמצעות cytometer זרימה מצויד לייזר יון ארגון (488-514 ננומטר) ומסנן bandpass כדי לאפשר זיהוי של פליטת פלואורסצנטיות ב 578 ננומטר. לרכוש 20,000 אירועים לדגימה בקצב זרימה של 30 μL / min בטמפרטורת החדר. נתח את הנתונים כמתואר להלן (סעיפים 3.2.7-3.2.10).
  2. ניתוח ציטומטרי זרימה של BMMCs עבור ערכה (CD117) וביטוי קולטן פני השטח FcεRI
    1. הסר בזהירות את המדיום התרבותי המכיל BMMCs מראש CNC / אגרוז / D-מניטול, הימנעות הג'ל, ולהעביר את התאים לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל.
    2. לשטוף BMMCs פעמיים עם PBS-0.5% BSA מסונן ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ו resuspend ב 180 μL של PBS המכיל 0.5% w / v BSA (1.5 × 106 תאים / מ"ל). מעבירים את התאים המחודשים לצלחת עגולה בת 96 בארות.
    3. הוסף 20 μL של 10x פתרונות עבודה נוגדן לתאים כדי להשיג ריכוז סופי של 0.06 מיקרוגרם / מ"ל של CD117 (c-Kit)-phycoerythrin (PE) ו 0.06 מיקרוגרם / mL של FcεRIα-allophycocyanin (APC), בהתאמה.
      הערה: יש להכין את פתרונות העבודה של נוגדני 10x ב- PBS-0.5% w/v BSA מעוקר מסנן.
    4. הוסף 20 μL של 10x איזוטיפ בקרת פתרונות עבודה המכילים גם חולדה IgG2b κ איזוטיפ control-PE או אוגר ארמני IgG איזוטיפ בקרה-APC כדי להפריד בארות המכילות תאים שלא הוכתמו עם אף אחד מהנוגדנים-פלואורופור מצומד בשלב 3.2.3.
      הערה: פקדי איזוטיפ, חולדה IgG2b κ איזוטיפ בקרה-PE ואוגר ארמני IgG איזוטיפ בקרה-APC משמשים לשליטה עבור התקשרות לא ספציפית של נוגדנים ל- BMMC. כמו BMMCs אינם מבטאים רמות גבוהות של FcR, יש רק לעתים רחוקות פלואורסצנטיות רקע גבוהה זוהתה עם נוגדנים בקרת איזוטיפ. הכן את פתרונות העבודה של בקרת איזוטיפ 10x ב- PBS-0.5% w/v BSA מעוקר מסנן.
    5. לדגור על צלחת 96-היטב עגול תחתון במשך 1 שעה ב 4 °C (60 °F) בחושך.
    6. לשטוף את התאים על ידי הוספת 200 μL של PBS-0.5% w / v חוצץ BSA לכל באר, וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב הכביסה פעם נוספת. הסר בזהירות את supernatant מבלי לגעת גלולה התא; להשאיר מאחור כמה supernatant כדי להבטיח כי גלולה התא נשאר ללא הפרעה.
    7. לאחר הכביסה, resuspend תאים ב 100 μL של 0.5% w /v BSA, 0.05% w /v נתרן אזיד ב PBS (pH 7.4) כי כבר סטרילי מסונן פעמיים עם מסנן מזרק בגודל 0.2 מיקרומטר. לרכוש נתוני פלואורסצנטיות בערוצי גלאי PE ו- APC באמצעות cytometer זרימה, כפי שמתואר לעיל בשלב 3.1.3.
    8. נתח נתונים באמצעות תוכנה המסוגלת להציג ולנתח קבצי נתונים ציטומטריים של זרימה עם הסיומת ".fcs".
    9. התחל ניתוח על-ידי התוויית פיזור קדימה (FSC) לאורך ציר x ופיזור הצד (SSC) לאורך ציר ה- y, ושער עבור אוכלוסיית התאים השמורים עם טווח FSC של log10 1.5-5.0 וטווח SSC של log10 0.75-3.25 בתאים הלא מטופלים והלא נגועים כפי שמוצג באיור 3A(i),(ii).
      הערה: פעולה זו משמשת כדי להבטיח כי פסולת תאים עם ערכי FSC ו- SSC נמוכים מסולקים מהניתוח. תאי פיסט הם בדרך כלל תאים גרגריים מאוד (SSC גבוה) וגדולים (FSC גבוה) בהשוואה לסוגי תאים אימונולוגיים אחרים, כגון מונוציטים ולימפוציטים.
    10. לאחר מכן, ליצור FSC לעומת SSC נקודות פרופילים של דגימות לא מטופלות כי כבר מוכתמים עם צבע, נוגדנים, או פקדי איזוטיפ, ולקבל עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת (MFI) בערוצי PE או APC על פי ספקטרום הפליטה של הצמד או צבע הנוגדנים-פלואורופור הספציפיים המשמשים. החל את אותה קבוצה של שערים ופרמטרים על כל דגימות BMMC דגירה עם מצעים שונים CNC / אגרוז / D-מניטול מוכתם עם פקדי איזוטיפ המתאימים, נוגדנים, או צבע; השג MFIs.
      הערה: בעיקרו של דבר, החלקות הנקודות FSC לעומת SSC של הדגימות המוכתמות שלא טופלו צריכות להיות מוערכות מדגימות לא מטופלות/לא נגועות, המתקבלות בשלב 3.2.9, כדי להבטיח שהליך ההכתמה לא ישנה את גודל התא (נמדד על ידי FSC) או את הגרגריות (נמדד על-ידי SSC) (איור 3A(i),(ii)).
    11. חשב MFIs ממוצע ושגיאה סטנדרטית של ממוצע (SEM) עבור כל מדגם מתוך 4 ניסויים עצמאיים ואחריו יצירת גרפים באמצעות חבילת תוכנה לניתוח סטטיסטי.
    12. הכן שכבות-על של היסטוגרמה בתוכנת ניתוח הנתונים הציטומטרית של הזרימה (איור 3B, 4A(ii),B(ii)).

4.3D ביו-הדפסה של מצעים הידרוג'ל FNC/נתרן אלגינט

הערה: הביו-הדפסה בתלת-ממד המשמשת במחקר זה היא מערכת שחול פנאומטית המצוידת בשני ראשי הדפסה עצמאיים הנשלטים בטמפרטורה. הדיו הביו-חומרים המשמש להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של פיגומי ההידרוג'ל מנוסחים (א) מננו-תאית פיברילר (FNC) בעלת לחות רבה, הדומה מבחינה מורפולוגית לקולגן, (ב) נתרן אלגינט ו-(ג) D-מניטול. הוא מסופק כמו מתלה הידרוג'ל סטרילי במחסניות 3 מ"ל שאליהן ניתן לחבר חרירי ביו-הדפסה חרוטיים סטריליים (22, 25 או 27 גרם).

  1. השתמש בפרוטוקול זה עם ראשי ההדפסה ומודפס בטמפרטורת החדר, שם טמפרטורת החדר היא 20-25 מעלות צלזיוס.
  2. אחסן את מחסניות הדיו הביו-חומרים ב- 4 °C (4 °F) כדי לשמור על היציבות של מרוכבים הידרוג'ל. לפני תחילת הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, יש להסיר מחסנית (3 מ"ל) מהמקרר ולאפשר לה להתפרק לטמפרטורת החדר.
  3. התקנת מחסנית ביוינק על ביו-הדפסה מסוג INKREDIBLE+ תלת-ממדי
    1. הסר את כובעי הקצה הכחולים ממחסנית הדיו הביו-חומרית בגודל 3 מ"ל (איור 5B(i)), והדבק זרבובית ביו-הדפסה חרוט סטרילית של 22 גרם (כחול) לקצה הנעילה של מחסנית הביוינק.
      הערה: חיוני להצמיד את זרבובית הביו-הדפסה החרוטית הרצויה למחסנית הביו-וינק לפני התקנת המחסנית וביצוע שלבי הכיול הבאים, שכן אי ביצוע פעולה זו יגרום לכיול לא תקין של ציר z של הביו-הדפסה בתלת-ממד.
    2. חבר את צינורות אספקת לחץ האוויר עבור ראש ההדפסה 1 (PH1, משמאל) לקצה הנגדי של המחסנית, והכנס את המחסנית עם זרבובית ההדפסה החרוטית המצורפת שלה לחריץ האנכי של PH1 (איור 5A(ii)).
    3. הונחו היטב את המחסנית ב-PH1 עם זרבובית הטביעה החרוטית המשתרעת מתחת לראש ההדפסה. הדק את הבורג ב-PH1 בכיוון השעון עד להדק את האצבע כדי לנעול את מחסנית הביוינק במקומה. שים לב כי הדפסה ביולוגית 3D יכול להתבצע עם PH2 נשאר ריק.
  4. כיול צירי x-y-z של הביו-הדפסה תלת-ממדית
    1. הפעל את הביו-הדפסה תלת-ממדית והפעל את תוכנת הביו-הדפסה במחשב המחובר להדפסה הביולוגית תלת-ממדית באמצעות כבל USB 2.0.
    2. בתוכנה, לחץ על לחצן CONNECT כדי לסנכרן את התוכנה עם הביו-הדפסה בתלת-ממד.
      הערה: הסינכרון מצליח כאשר אורות הדיודה הפולטים אור אולטרה סגול של ראש ההדפסה מופעלים לסירוגין, ומאוורר מסנן HEPA עובר לסירוגין שוב ושוב. התוכנה חייבת להיות מסונכרנת עם הביו-הדפסה בתלת-ממד לפני ביות צירי הביו-הדפסה וכיול נקודת ההתחלה, כפי שמתואר בשלבים הבאים.
    3. שים לב לארבע אפשרויות בתפריט הבקרה הראשי של הביו-הדפסה בתלת-ממד: (i) הכנת ביו-הדפסה, (ii) ביו-הדפסה, (iii) תפריט כלי שירות ו-(iv) SCREEN STATUS. בחרו באפשרות 'הכנת ביו-הדפסה ' ולאחר מכן גלול מטה ובחרו באפשרות 'צירי בית' .
      הערה: הביו-הדפסה בתלת-ממד תזיז את הרכב ראש ההדפסה אחורה ושמאלה כדי לכייל את צירי ה- y וה- x, בהתאמה. לאחר מכן, כאשר ראשי ההדפסה מושהים במיקום השמאלי הרחוק, הביו-הדפסה תעלה את המודפס עד שמתג הכיול ציר z (הממוקם על נייר ההדפסה) ייצור קשר עם זרבובית הביו-הדפסה החרוטית המותקנת על ראש ההדפסה 1
    4. לאחר כיול מוצלח של צירי x-y-z , שים לב להנמכה הקלה של מיטת ההדפסה ובהעתקת ראשי ההדפסה אל מעל נקודת המרכז של מיטת ההדפסה (איור 5A(i)).
  5. כיול נקודת התחלה של הביו-הדפסה להדפסה ביולוגית בלוחות של 24 בארות
    1. הסר צלחת תרבות סטרילית 24-well מן העטיפה פלסטיק אטום שלה, ולסמן נקודה של בנקודת המרכז של גם D1 בחלק התחתון של הצלחת עם סמן קבוע. הסר את כיסוי הצלחת, ומניחים את צלחת התרבות 24-well על המודפס עם גם D1 הממוקם בפינה השמאלית הקדמית של מיטת ההדפסה.
    2. בתפריט הבקרה הראשי, בחר תפריט כלי עזר ולאחר מכן בחר הזז ציר. הזז את ראשי ההדפסה במרווחים של 1 מ"מ לאורך צירי x ו- y עד שזרבובית ההדפסה הביולוגית החרוטית של PH1 נמצאת ישירות מעל הנקודה המסומנת תחת באר D1. במידת הצורך, כוונן את המיקום של זרבובית הביו-הדפסה החרוטית מעל הנקודה על-ידי הזזת ראשי ההדפסה במרווחים של 0.1 מ"מ.
    3. הקלט את קואורדינטות x ו- y של זרבובית הביו-הדפסה החרוטית כאשר ישירות מעל מרכז הבאר D1, כפי שצוין במסך לוח הבקרה של הביו-הדפסה תלת-ממדית.
      הערה: במקרה של ביו-הדפסה תלת-ממדית INKREDIBLE+ המשמש כאן, הקואורדינטות x ו- y הן כדלקמן: x : -46.5 ו - y : -27.5. קואורדינטות אלה משמשות כנקודת המוצא במרכז ה-D1 של באר להדפסה ביולוגית בצלחת של 24 בארות.
    4. לאחר מכן, הרימו את המודפס במרווחים של 1 מ"מ עד שהתחתית של הבאר D1 כמעט נוגעת בזרבובית הביו-הדפסה החרוטית המותקנת בראש ההדפסה 1. כוונן את תנועת המודפס במרווחים של 0.1 מ"מ במידת הצורך (איור 5A(ii)). לאחר מכן, מתפריט כלי שירות, בחר באפשרות כיול ציר Z ובחר ואשר עוד יותר את האפשרות כיול STORE Z .
    5. חזור לתפריט הראשי ובחר באפשרותכן ביו-הדפסה . גלול מטה ובחר באפשרות CALIBRATE Z .
      הערה: הביו-הדפסה בתלת-ממד תוריד כעת את המודפסת לאחר ביצוע מוצלח של כיול ציר z (איור 5A(iii)).
  6. מעדכן קובץ G-code של לוחית 24-well עם קואורדינטות נקודת התחלה נכונות
    1. פתח את קובץ הקוד הגיאומטרי (G-code) שסופק בתוכנת הביו-הדפסה (קובץ משלים 1).
      הערה: קובץ G-code זה, בעל 24 בארות, מקודד את ההדפסה של מבנים רב-שכבתיים בני 5 x 5 x 1 מ"מ בכל באר (איור 5C(i),(iii)). ניתן להשתמש בקבצי קוד G שסופקו עם כל תוכנת הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.
    2. שים לב כי שורה 1 של קובץ G-code קורא G0 X-50.0 Y-33.5 ; מיקום מרכזי של D1 היטב. עדכן את קואורדינטות x ו- y בשורה 1 עם הערכים שהושגו בשלב 4.5.3, כלומר, שורה 1 צריכה לקרוא כעת G0 X-46.5 Y-27.5 ; מיקום מרכזי של D1 היטב. שמור את הקובץ תחת שם חדש.
      הערה: הליך זה משמש לכיול קובץ קוד ה- G כך שההדפסה תתחיל במרכז באר D1 בהתבסס על הקואורדינטות x,y של הביו-הדפסה התלת-ממדית הספציפית הנמצאת בשימוש. גישה זו יכולה לשמש לכיול קובץ 24-צלחת G-קוד להדפסה עם כל שחול ביו-הדפסה תלת-ממדית. לצורך מחקר זה, רק המחצית השמאלית של צלחת 24-well, כלומר, בארות A1-3, B1-3, C1-3, ו- D1-3 הודפסו. קובץ G-code נפרד המקודד הדפסה של מבנים רב-שכבתיים בגודל 5 x 5 x 1 מ"מ ברשת 3 x 4 מסופק גם הוא (קובץ משלים 2, איור 5C(ii)).
  7. התאמת לחץ שחול עבור Printhead 1 (PH1)
    1. ודא שהמשאבה הפנאומטית מחוברת היטב ליציאת צריכת האוויר האחורית של הביו-הדפסה התלת-ממדית INKREDIBLE+ והדליק את המשאבה הפנאומטית.
    2. שלף את ידית הבקרה הקדמית הממוקמת בצד ימין של הביו-הדפסה התלת-ממדית INKREDIBLE+ 3D.
      הערה: ידית הבקרה הקדמית מתאימה את הלחץ ל- PH1, בעוד ידית השליטה האחורית מתאימה את הלחץ ל- PH2.
    3. שים לב למדי הלחץ הדיגיטליים עבור PH1 ו- PH2 הממוקמים בחזית הביו-הדפסה כל אחד לקרוא קרוב ל 0 kPa. סובבו באיטיות את ידית הבקרה הקדמית בכיוון השעון עד שהלחץ המצוין במד השמאלי של PH1 יגיע ל-12 kPa (איור 5A(iii)).
    4. מניחים נייר טישו מקופל או חתיכת סרט איטום עמיד למים מתחת לזרבובית ההדפסה של המחסנית המותקנת, ונזהרים שלא לגעת בזרבובית ההדפסה.
    5. מתפריט הבקרה הראשי בהדפסה הביולוגית תלת-ממדית, בחרו 'הכינו ביו-הדפסה'.
    6. נווט אל ההפעלה של PH1 ובחרו בו. שים לב שהדיו הביו-חומריםי מתחיל להלל מהזרבובית. במידת הצורך, להגביר את לחץ השחול על ידי סיבוב ידית הבקרה בכיוון השעון עד הדיו biomaterial הוא בלם חוט רציף, ולתעד את הגדרת הלחץ החדשה. עבוד במהירות כדי להימנע מבזבוז דיו ביו-חומרי.
    7. בחר בטל את PH1 כדי להפסיק את שחול הדיו הביו-חומריםי, להסיר את נייר הטישו או את הסרט המכיל את הדיו הביו-חומרים המובלט ממיטת ההדפסה ולסגור את דלת הביו-הדפסה.
      הערה: הביו-הדפסה התלת-ממדית תדליק באופן אוטומטי את אספקת לחץ האוויר ל-PH1 במהלך ההדפסה בהתאם להוראות קובץ הקוד G.
  8. ביו-הדפסה תלת-ממדית של מצעים הידרוג'לים רקטלינאריים בפורמט צלחת של 24 באר
    1. מתפריט הבקרה הראשי בהדפסה הביולוגית תלת-ממדית, בחר תפריט כלי עזר. נווט אל הדפסה SD ותבחר, אשר יאפשר לתוכנת הביו-הדפסה לשדר קבצי קוד G להדפסה של ביו-הדפסה תלת-ממדית.
    2. לחץ על כפתור LOAD בתוכנת הביו-הדפסה ובחר את קובץ קוד G המעודכן של לוחית 24 טוב שנשמר בשלב 4.6.2.
    3. בלוח הבקרה הימני בתוכנה, בחר בכרטיסיה הצגה לפני הדפסה ולחץ על לחצן PRINT כדי להתחיל בהדפסה ביולוגית ב- D1.
      הערה: אם משתמשים בקובץ קוד G של לוחית ה-G של רשת 3 x 4, ההדפסה הביולוגית תסתיים היטב A3 של הלוח בן 24 הבאר (איור 5C(ii),D), בניגוד ל-A6 אם מודפסת צלחת מלאה של 24 בארות.
    4. עם השלמת הדפסה ביולוגית של המבנים המשעשעים, לכסות את צלחת 24 באר עם המכסה שלה ולהעביר אותו לארון בטיחות ביולוגית Class II.
    5. יש לטבול כל מבנה רקטלינארי בשתי טיפות של תמיסת CaCl2 סטרילית של 50 מ"מ (איור 5B(ii)), ולדגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      הערה: זה משמש כדי לחצות באופן יוני את שרשראות הפולימר אלגינט עם יונים Ca2 + ולאפשר מבנים רקטלינאריים לשמור על השלמות המבנית שלהם.
    6. שאפו בזהירות את תמיסת CaCl2 מכל מבנה, ושטפו פעם אחת במ"ל אחד של PBS 1x (pH 7.4) כדי להסיר עודף CaCl2 (איור 5D).
    7. כדי למנוע התייבשות של מבני ההידרוג'ל המודפסים ביו-מודפסים, שמרו על המבנים המתרוקנים המודפסים בהדפסה ביולוגית בתלת-ממד ב-PBS 1x טרי עד שה-BMMCs יהיו מוכנים לזרעים על המבנים (איור 5D).

5. דגירה של BMMCs על פיגומים רקטלינאריים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית ובדיקת כדאיות

  1. דגירה של BMMCs על פיגומי הידרוג'ל רקטלינאריים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית
    1. עליקות זרעים של BMMCs על הפיגומים הרקטיניים המודפסים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית במשולש במשך ארבעה משכי זמן שונים, למשל, 6, 18, 24 ו-48 שעות, כך שכל הטיפולים מסתיימים בו זמנית. השתמש ב- BMMCs שנזרעו לבארות ריקות במשולש עבור אותם משכי זמן כמו פקדים שאינם מטופלים.
    2. מעבירים באופן אספטי BMMCs מבקבוק תרבות T175 cm2 לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל, ומעבירים את ה- BMMCs ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. יש להעריך מחדש את הכדור ב-50 מ"ל של מדיום RPMI מלא טרי המכיל 20 ננוגרם/מ"ל של IL-3, וחשב את צפיפות התאים החיים על-ידי ספירת עליקוט של BMMCs מוכתמים בכחול טריפאן באמצעות המציטומטר.
    4. בהתבסס על צפיפות התא המחושבת בשלב 5.1.3, הכן aliquot 6 מ"ל של השעיית BMMC בצפיפות סופית של 1 × 106 תאים / מ"ל.
    5. עבור הגדרת הדגירה 48 שעות, שאפו PBS מבארות A1-3 המכילים את פיגומי הידרוג'ל רקטליניאריים מודפסים 3D, ופיפטה 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים / מ"ל) השעיה לתוך כל באר. כמו כן, פיפטה 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים / מ"ל) השעיה לתוך בארות A4-6 ללא מבנים מודפסים ביולוגית כדי לשמש בקרה לא מטופלת. לדגור את שאר בארות המכילות פיגומים ביו-מודפסים (B1-3, C1-3, D1-3) ב- RPMI ללא תוספים כדי למנוע התייבשות עד שיגיע הזמן המתאים לזרוע עם BMMC למשך הטיפול 24, 18 ו 6 שעות. מלא את הבארות ללא פיגומים מודפסים ביולוגית (B4-6, C4-6, D4-6) עם 1 מ"ל של PBS עד הזמן המתאים הוא הגיע לזרוע עם BMMCs עבור 24, 18, ו 6 שעות נקודות זמן.
    6. לדגור על צלחת 24-באר ב 37 °C (5° פחמן דו חמצני ) אטמוספרה לחה 5%.
    7. עבור הגדרת הדגירה של 24 שעות, שאפו את ההשעיה של בינוני/חיץ תרבות קיימים מבארות B1-6, וזרע 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים/מ"ל) מתלים לתוך בארות אלה. תחזיר את הצלחת לאינקובטור.
    8. עבור הגדרת הדגירה של 18 שעות, שאפו את ההשעיה של בינוני/חיץ תרבות קיימים מבארות C1-6, וזרע 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים/מ"ל) לבארות אלה. תחזיר את הצלחת לאינקובטור.
    9. עבור הגדרת הדגירה של 6 שעות, שאפו את ההשעיה של בינוני/חיץ תרבות קיימים מבארות D1-6, וזרע 1 מ"ל של BMMC (1 × 106 תאים/מ"ל) מתלים לתוך בארות אלה. תחזיר את הצלחת לאינקובטור.
    10. לסיום הדגירה, חלק דגימות מכל באר של צלחת 24-well עבור (i) PI כתמים וניתוח על ידי cytometry זרימה, (ii) XTT הכדאיות תא הבדיקה, ו (iii) LDH שחרור הבדיקה. לכן, להבטיח כי צלחת עגולה 96-באר ואת צינורות microfuge 1.5 מ"ל הדרושים מסומנים הרבה לפני נקודת הקצה של הדגירה.
  2. דגימת תאים לבדיקה מטבולית של XTT
    1. תדפיסו מחדש את ה-BMMCs במדיום התרבותי בתוך כל באר, תוך נזהרת שלא לפגוע ולפרק את פיגומי ההידרוג'ל המודפסים בתלת-ממד.
    2. העברה אספטית 40 μL של השעיית BMMC הומוגני מכל באר צינורות מיקרופוגה סטריליים 1.5 מ"ל המכילים 760 μL של מדיום RPMI מלא טרי (נפח סופי = 800 μL), ומערבולת לזמן קצר לערבב.
    3. יש לחלק 100 מיקרו-אל של מתליות BMMC מדוללות במשולש ללוח מיקרו-תיימר שטוח בעל 96 בארות המתאימה למדידות ספיגה (ראו טבלת החומרים) בספקטרופוטומטר מיקרו-פלט.
    4. חלק 50 μL של פתרון עבודה XTT לכל באר המכילה את ההשעיה של תא BMMC באמצעות מיקרופיפט רב ערוצי.
      הערה: הכן פתרון עבודה XTT על ידי ערבוב 5 מ"ל של ריאגנט XTT עם 100 μL של ריאגנט צימוד אלקטרונים. להפשיר רכיבים אלה מ -20 °C (50 °F) באמבט מים 37 °C (37 °F) מיד לפני השימוש.
    5. לדגור על צלחת 96-well ב 37 °C (5°F) באטמוספירה 5% CO2 לח במשך 24 שעות.
    6. בסוף הדגירה, להסיר את צלחת 96-באר מן האינקובטור ולאפשר להתקרר לטמפרטורת החדר. רשומות ערכי ספיגה על ספקטרופוטומטר מיקרו-לוח ב 450 ננומטר עם חיסור רקע ב 650 ננומטר.
  3. דגימה על-טבעית לבדיקת להידרוגנאז לקטט (LDH)
    1. העבר את ההשעיות BMMC הנותרות (960 μL) מכל באר של צלחת 24-well לצינורות microfuge, וכדור התאים ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. Pipette שלושה 100 aliquots μL של תרבית התא supernatant מכל צינור microfuge לתוך צלחת 96-well microtiter שטוח תחתון. השלך את שאריות supernatants מכל צינור microfuge, ולשמור על כדורי BMMC להכתמת נוסף עם PI בסעיפים 5.4.1-5.4.8.
    3. Pipette 50 μL של פתרון העבודה LDH לתוך כל 100 μL aliquot של supernatant.
      הערה: עיין בקובץ משלים 3 להכנת ריאגנטים לבדיקת LDH.
    4. דגירה במשך שעה בחושך בטמפרטורת החדר.
    5. פיפטה 50 μL של 1 M חומצה אצטית לכל באר כדי לעצור את התגובה.
    6. רשומות ערכי ספיגה על ספקטרופוטומטר מיקרו-לוח ב 490 ננומטר עם חיסור רקע ב 680 ננומטר.
  4. ניתוח ציטומטרי זרימה של הכדאיות BMMC באמצעות אי הכללת פרופידיום יודיד (PI)
    1. resuspend כדורי BMMC במאגר לשטוף זרימה (PBS [pH 7.4] המכיל 0.5% w / v BSA), וכדור התאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. חזור על שלב הכביסה עם חוצץ שטיפת זרימה פעם נוספת.
    3. יש תנצל מחדש כל גלולה BMMC ב-400 מיקרו-אל של מאגר שטיפת זרימה.
      הערה: יהיו 24 דגימות BMMC resuspended בסך הכל: 12 דגימות BMMC דגירה על מצעים הידרוג'ל מודפס ביו-מודפס (4 נקודות זמן משולש) ו 12 דגימות BMMC דגירה בבארות ללא מבנים מודפסים ביולוגית (4 נקודות זמן משולש).
    4. בצלחת מיקרוטיטר 96-באר עגולה, pipette 20 μL של חוצץ לשטוף זרימה לתוך בארות A1-12 ו - B1-12. באותה צלחת microtiter, pipette 20 μL של פתרון כתמי PI 10x (100 מיקרוגרם / מ"ל PI במאגר לשטוף זרימה) לתוך בארות C1-12 ו - D1-12.
    5. מחלקים 180 μL מתוך 12 דגימות BMMC המודגרות על מצעים הידרוג'ל מודפסים ביולוגית לבארות A1-12 (מדגם אחד לבאר). יש לחלק 180 μL מתוך 12 דגימות BMMC המוגררות ללא מצעים הידרוג'ל מודפסים ביולוגית לבארות B1-12 (דגימה אחת לבאר). השתמש בדגימות BMMC שניתנו לבארות A1-12 ו- B1-12 כפקדים לא נגועים עבור כל מצב טיפול (24 פקדים בסך הכל).
    6. מחלקים 180 μL מתוך 12 דגימות BMMC המודגרות על מבנים מודפסים ביולוגית לבארות C1-12 (מדגם אחד לבאר). מחלקים 180 μL מתוך 12 דגימות BMMC דגירה ללא מבנים מודפסים ביולוגית לתוך בארות D1-12 (מדגם אחד לבאר).
      הערה: דגימות BMMC בבארות C1-12 ו- D1-12 יוכתמו בריכוז PI יעיל סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל (24 דגימות מוכתמות בסך הכל).
    7. לדגור על הצלחת במשך שעה אחת ב 4 °C (75 °F) או 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    8. בסוף תקופת הדגירה, לנתח את הדגימות ישירות מצלחת microtiter על cytometer זרימה כפי שתואר בעבר תחת סעיף 3.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אחד המאפיינים המכריעים ביותר של דיו ביו-חומרים מוצלח או מצע תרבות הוא זה של תאימות ביולוגית. בראש ובראשונה, אסור שהמצע יזום מוות תאי. ישנן מספר שיטות ציטומטריות מבוססות מיקרוטיטר וזרימה לכימות הכדאיות של התא ונמק; עם זאת, שיטות אלה אינן מקובלות על ניתוח תאים המוטמעים בתוך מטריצת הידרוג'ל. בפרוטוקול זה, המגבלה הנ"ל עוקפת על ידי זריעת ה- BMMCs על מצע ההידרוג'ל או הפיגומים המודפסים ביו.. לאחר תקופת דגירה ספציפית (6-48 שעות במחקר זה), BMMCs נקצרים בקלות על ידי מיקרופיפיט ללא צורך בהפרעה מכנית או הידרוליזה של מצע הידרוג'ל או פיגום מודפס ביולוגית, אשר אחרת יגרום נזק פיזי לתאים. הכדאיות של BMMCs מנותח במהירות באמצעות שיטת החמילאות PI באמצעות cytometry זרימה. PI הוא צבע אטום ממברנה שאינו נכלל בתאים קיימא עם קרום התא שלם ופלואורסים רק על intercalating בין זוגות הבסיסים של DNA16.

ככזה, רק תאים עם קרום התא נפגעים הם חדוריים PI ולכן, יהיה פלואורסצ'ה. ניתוח חמיצות PI לא הראה שינויים הכדאיות BMMC כאשר הם מתורבתים על מצע CNC / אגרוז / D-מניטול. למעשה, אף אחד מהריכוזים של CNC שנבדקו (עד 12.5% w/v) לא גרם לתופעות לוואי כלשהן על הכדאיות של BMMC בהשוואה ל- BMMCs המתורבתים בהיעדר מצעים הידרוג'ל CNC/אגרוז/D-מניטול (איור 3B,C). זה גם חיוני כי bioink או מצע התרבות לא לשנות את המורפולוגיה של התאים. בהתבסס על החלקות הציטומטריות של הזרימה לעומת SSC, מצע ההידרולוג'ל עם ריכוז ה- CNC הגבוה ביותר (12.5% w/v) לא שינה את הגודל המקורי (FSC) או את הגרגיריות (SSC) של ה- BMMCs בהשוואה ל- BMMCs בתרבית בהיעדר מצעים הידרוג'ל CNC / אגרוז / D-מניטול (איור 3A(i), (ii)).

מאפיין חשוב נוסף של דיו ביו-חומרים או מצע תרבית הוא שהוא חייב להחזיק ביכולת לשמור על הבידול והפנוטיפ של התאים בהם הוא תומך. שניים מהסמנים הביולוגיים המובהק ביותר של תאי התורן הם קולטן IgE בעל זיקה גבוהה, FcεRI, המאפשר תגובות BMMC לאנטיגנים ולקולטן גורם תאי הגזע, Kit (CD117), הנדרש להישרדות ובידול של תאי התורן. תאי פין בוגרים מוגדרים על ידי הביטוי של שני קולטני פני השטח האלה, ועל מצע bioink כדי לשמור אותם בתרבות, זה לא חייב לשנות באופן משמעותי את הביטוי של שני קולטנים אלה. נראה כי המצע CNC/agarose/D-mannitol הגדיל את הביטוי FcεRI וקיט בריכוזים CNC ≥ 2.5% (איור 4A(iii), B(iii)). מעניין, רמות הביטוי FcεRI וקיט גבוהות נותרו עקביות יחסית בין 2.5% ל -12.5% CNC, מה שמעיד על אפקט מישור ומציע השפעה שאינה תלויה בריכוז של CNC, אלא בפרמטר אחר של מרוכבים הידרוג'ל.

פיגומי הדיו הביו-חומרים של הידרוג'ל המודפסים ביו-ממדיים המיוצרים במחקר זה מורכבים מננו-תאית פיברילר (FNC), במקום ננו-תאית גבישית ונתרן אלגינט כג'לטור, במקום אגרוז. פיברילר nanocellulose תערוכות טופוגרפיות ננומטריות ברורות בהשוואה CNC17 אשר, בנוסף לארכיטקטורה microscale של 3D ביו-מודפס FNC ביו-ג'ל bioink מצעים, יכול להשפיע על הכדאיות של BMMCs. בעקבות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית וקישורים יוניים של פיגומי ביו-סינק FNC/אלגינט/D-מניטול (איור 6), BMMCs היו בתרבית לבד או על פיגומי הידרוג'ל בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית עבור 6, 18, 24 ו-48 שעות, בהתאמה, על מנת להעריך את השינויים הדינמיים בכדאיות של ה- BMMCs בתגובה לפיגומי FNC / alginate / D-mannitol, אם בכלל, על פני פרקי זמן ממושכים. בדיקת XTT הצביעה על כך שהפעילות המטבולית של ה-BMMCs בתרבית על פיגומי ההידרוג'ל המודפסים ביו-ממדיים נותרה עקבית יחסית ב-100% בכל נקודות הזמן שנבדקו בהשוואה ל-BMMCs בתרבית בלבד (איור 7A). התמוגה של תאים גורמת לשחרור LDH למדיום תרבית התא, אשר בדיקת LDH מזהה כפונקציה של פעילות אנזימטית חמצונית-רדוקטיבית שלה.

BMMCs תרבית על פיגומי הידרוג'ל ביו-מודפס 3D הציג עלייה תלוית זמן הדרגתית בשחרור LDH בהשוואה BMMCs תרבות בלבד; עם זאת, למגמה זו הייתה סטיית תקן לא משמעותית של פחות מ-9% (איור 7B). כתמי PI של ה-BMMCs בתרבית על פיגומי ההידרוג'ל המודפסים בתלת-ממד לא גילו שינויים משמעותיים ביכולת ה-BMMCs בהשוואה ל-BMMCs בתרבית בלבד בכל נקודת זמן (איור 7C). ראוי לציין, ה- MFI של BMMCs מוכתם PI על פיגומי הידרוג'ל ביו-מודפסים תלת-ממדיים נותר עקבי יחסית (PI-MFI של 7000) בכל נקודות הזמן והיה דומה ל- BMMCs בתרבית על מצע CNC / agarose / D-מניטול, אשר הציג PI-MFI עקבי של 7000 על פני כל ריכוזי CNC (2.5-12.5%). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים כי פיגומי הידרוג'ל FNC / אלגינט / D-מניטול אינם משפיעים לרעה על הכדאיות של BMMCs.

Figure 1
איור 1: האנטומיה של רגל העכבר, המתארת את השוקה ועצם הירך שמהם מבודד מח העצם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 2
איור 2: הכנת מצע הידרוג'ל CNC/אגרוז/D-מניטול. (א) סכמטי של CNC / אגרוז / D-מניטול הידרוג'ל מצע פרוטוקול הכנה. (ב) הכנות CNC/אגרוז/D-מניטול (0, 1, 2.5, 5, 10 ו-12.5% (w/v) CNC ב- PBS / אגרוז / D-מניטול) נטענו על צלחת 24-well ב quadruplicate כפי שמודגם. קיצורים: PBS = תמיסת מלח חוצץ פוספט; CNC = ננו-תאי גבישי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח ציטומטרי זרימה של הכדאיות של BMMC באמצעות אי-הכללה של פרופיליום יודיד בעקבות דגירה על מצעים CNC/ אגרוז / D-מניטול. BMMCs הוסרו ממצעי הידרוג'ל CNC / אגרוז / D-מניטול, נשטפו פעמיים, הוכנסו מחדש ב- PBS-0.5% w / v BSA, מוכתמים ב- PI למשך שעה אחת ב - 4 °C (4 °C), ונותחו על ידי cytometry זרימה (n = 4). בסך הכל נרכשו 20,000 תאים במדגם, כולל זיהוי פליטת פלואורסצנטיות PI בערוץ PE. ניתוח נתונים בוצע באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה. (A) פיזור קדימה (ציר x) לעומת ניתוח התוויית נקודות של פיזור צד (ציר y) של אוכלוסיית התאים הכוללת מ- (i) BMMC שליטה לא מטופלת (0% CNC/agarose/D-mannitol) ו-(ii) BMMCs בתרבית על 12.5% CNC/אגרוז/D-מניטול, המתארים את אוכלוסיית התאים המגודרים המשמשים לניתוח נתונים. (ב) פרופיל שכבת-על של תאים מגודרים (לא מזוהמים או מוכתמים ב- PI), מ- BMMCs שליטה לא מטופלת (0% CNC / אגרוז / D-מניטול) ו- BMMCs בתרבית על 12.5% CNC / אגרוז / D-מניטול. (C) BMMCs היו בתרבית על מצעים CNC / אגרוז / D-מניטול שונים (1-12.5% (w / v) CNC) עבור 18 שעות, ואת הכדאיות התא נקבע על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה של תאים מוכתמים PI. ייצוג גרפי של MFIs PI עבור BMMCs דגירה על מצעים שונים CNC / אגרוז / D-מניטול (1-12.5% (w /v) CNC) ביחס ל- BMMCs שלא טופלו ומוכתמים ב- PI. קיצורים: BMMCs = תאי פין שמקורם במח העצם; CNC = ננו-תאי גבישי; PBS = תמיסת מלח עם אגירה בפוספט; BSA = אלבומין סרום בקר; PI = פרופידיום יודיד; PE = פיקוריתרין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח ציטומטרי של ביטוי קולטן פני השטח של FcεRI וקיט (CD117). BMMCs היו תרבותיים או בהיעדר או נוכחות של מצעים CNC / אגרוז / D-מניטול עבור 18 שעות, הוסרו, ונותחו עבור ביטוי קולטן. הנתונים מייצגים 4 שכפולים. פיזור קדימה (ציר x) לעומת פיזור צד (ציר y) נקודה של אוכלוסיית התאים הכוללת במדגם BMMC הלא מטופל (0% CNC / agarose / D-מניטול), מוכתם עם (A)(i) נוגדן בקרת איזוטיפ-APC או (B)(i) נוגדן בקרת איזוטיפ-PE, ואוכלוסיית התא המגודר המשמש לניתוח נתונים. פרופילי שכבת-על של BMMCs מגודרים (מוכתמים בנוגדן בקרת איזוטיפ או (A)(ii) נוגדן נגד FcεRI-APC או (B)(ii) נוגדן אנטי-Kit-PE), דגירה לבד (0% CNC/אגרוז/D-מניטול) או על מצעים CNC/אגרוז/D-מניטול של 12.5%. BMMCs היו תרבותיים במשך 18 שעות על מצעים שונים CNC / אגרוז / D-מניטול (1-12.5% (w / v) CNC) ואחריו ניתוח ביטוי קולטן פני השטח FcεRI וקיט, בהתאמה, באמצעות cytometry זרימה (n = 4). ייצוג גרפי של MFIs של BMMCs מוכתמים עם (A)(iii) אנטי FcεRI-APC או (B)(iii) נוגדנים אנטי-Kit-PE, בהתאמה, בעקבות תרבית על מצעים שונים CNC / אגרוז / D-מניטול (1-12.5% (w /v) CNC) ביחס לתאים שלא טופלו (0% CNC) ומוכתמים באופן דומה. קיצורים: CNC = ננו-תאי גבישי; APC = אלופיקוסיאנין; PE = פיקוריתרין; BMMCs = תאי פין שמקורם במח העצם; MFI = עוצמות פלואורסצנטיות ממוצעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ציוד ביו-הדפסה תלת-ממדי ומתכלים הנדרשים להדפסה ביולוגית בגודל 5 x 5 x 1 מ"מ פיגומי הידרוג'ל רב שכבתיים בעלי 2 שכבות בתבנית של 24 בארות. (A)(i) ביו-הדפסה תלת-ממדית פנאומטית עם מיקום ההרכבה של ראש ההדפסה בעמדת המנוחה שלה עם השלמת הביות של צירי x-y-z שלה. (א) (ii) כיול נקודת התחלה של ראש הדפסה 1 עם מחסנית ביו-ink מותקנת ומיקום של זרבובית ההדפסה ישירות מעל אמצע באר D1 במידות x-y-z . (א) (iii) מיקום PH1 בעקבות כיול ציר z ולחץ ההבלטה של PH1 מוגדר ל- 12 kPa. (ב) (i) מחסנית ביוינק (3 מ"ל) המכילה ניסוח דיו ביו-חומרי NFC/אלגינט/D-מניטול. (ב) (ii) מתקן טיפות של פתרון קישור CaCl2 50 mM CaCl2 . (ג) (1) ייצוג סכמטי של פריסת הדפסה מקובץ קוד G המקודדת את ההדפסה של פיגומי הידרוג'ל רב-שכבתיים 5 x 5 x 1 מ"מ דו-שכבתיים בכל בארות של צלחת 24-well. (ג) (ii) ייצוג סכמטי של פריסת הדפסה מקובץ קוד G המקודדת הדפסה של פיגומי הידרוג'ל רב-שכבתיים בגודל 5 x 5 x 1 מ"מ דו-שכבתיים רק בבארות A1-3, B1-3, C1-3 ו- D1-3 של צלחת 24-well. (ג) (iii) תצוגה מורחבת של תבנית פיגומי הידרוג'ל 5 x 5 x 1 מ"מ 2-שכבה של ביונק הידרוג'ל בתוכנית החתכה, Slic3r. (ד) תצוגה עליונה של פיגומי הידרוג'ל ביו-סינגל תלת-ממדיים תלת-ממדיים בגודל 5 x 5 x 1 מ"מ 2 פיגומי הידרוג'ל רב-שכבתיים בפורמט של 24 בארות שקועים ב-PBS. קיצורים: 3D = תלת מימדי; PH1 = ראש הדפסה 1; NFC = תאית ננו-פיברילר; G-קוד = קוד גיאומטרי; PBS = תמיסת מלח עם אגירה בפוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תרשים סכמטי המתאר זרימת עבודה של ביו-הדפסה תלת-ממדית ותרבות BMMC בפיגומי הידרוג'ל FNC/אלגינט/D-מניטול. הדפסה תלת-ממדית של פיגומי הידרוג'ל עם ביו-סינק FNC/אלגינט/D-מניטול מקובץ קוד G המקודד תבנית רשת דו-שכבתית בגודל 5 x 5 x 1 מ"מ, קישור של פיגומי ההידרוג'ל עם CaCl2, ופולחן של BMMCs על המבנים הידרוג'ל FNC/Alginate/D-mannitol מוצלבים. קיצורים: 3D = תלת מימדי; דו-ממדי = דו-ממדי; G-קוד = קוד גיאומטרי; FNC = ננו-תאי פרברילר; BMMCs = תאי פין שמקורם במח העצם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: צילומטריית זרימה (PI) ומיקרו-תייטר (XTT ו-LDH) בדיקות של כדאיות BMMC בעקבות דגירה בפיגומים FNC/alginate/D-מניטול. (A) נתוני בדיקות מטבוליות של תאים (XTT) עבור BMMCs בתרבית על מצעים של ביאנק FNC/Alginate/D-mannitol עבור 6, 18, 24 ו-48 שעות, בהתאמה. ערכים מוצגים כאחוז מהנתונים המטבוליים של XTT עבור BMMCs בתרבית בלבד עבור 6, 18, 24 ו- 48 שעות, בהתאמה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (n=3). (B) נתוני לבדיקת נתונים של אנזים LDH עבור BMMCs בתרבית על פיגומי FNC / Alginate / D-מניטול ביו-מנטול עבור 6, 18, 24 ו 48 שעות, בהתאמה. הערכים מוצגים כשינויים מתקפלים ביחס לאנזים LDH ששוחרר על ידי BMMCs בתרבית בלבד במשך 6, 18, 24 ו- 48 שעות, בהתאמה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (n=3). (ג) זרימה נתונים ציטומטריים של BMMCs מוכתמים PI שהיו בתרבית או לבד או על פיגומי FNC / Alginate / D-מניטול ביו-ink עבור 6, 18, 24, ו 48 שעות, בהתאמה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (n=3). קיצורים: LDH = לקטט דהידרוגנאז; BMMCs = תאי פין שמקורם במח העצם; FNC = ננו-תאי פרברילר; PI = פרופידיום יודיד; MFI = עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1.1.1. בקבוק RPMI 500 מ"ל (HyClone, GE Healthcare, ארה"ב)
1.1.2. 4 מ"מ ל-גלוטמין (גיבקו, וולטהאם מסצ'וסטס, ארה"ב)
1.1.3. 50 מ"מ β-מרקפטואתנול (פישר סיינטיפיק, המפטון, ניו המפשייר, ארה"ב)
1.1.4. 1 מ"מ נתרן פירובט (גיבקו)
1.1.5. 100 פניצילין U/mL (גיבקו)
1.1.6. 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (גיבקו)
1.1.7. 0.1 mM חומצות אמינו לא חיוניות (Gibco)
1.1.8. 25 מ"מ HEPES (פישר)
1.1.9. 10% חום מומת FBS (גיבקו)
1.1.10. 30 ננוגרם ng/ mL עכבר רקומביננטי IL-3 (Peprotech, רוקי היל, ניו ג'רזי, ארה"ב)

טבלה 1: השלמת תוספי מדיה RPMI-1640.

קובץ משלים 1. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ייצור של רקמות ביו-מימטיות תלת-ממדיות דורש מיזוג מוצלח של הביו-וינק, המחקה רכיבים של המטריצה החוץ-תאית, עם הרכיבים התאיים ליצירת אנלוגים פיזיולוגיים של רקמות ויוו . זה מחייב שימוש בתאים ראשוניים, ולא תאים שעברו טרנספורמציה, בעת ייצור רקמות ביו-מימטיות פיזיולוגיות. תאים אימונולוגיים ראשוניים, כגון תאי פיטום, עם זאת, רגישים במיוחד להשפעות ציטוטוקסיות ושינויים פנוטיפיים שעשויים להיות מופעלים על ידי מטריצת הביוינק עצמה, שאינה רצויה. לכן, היכולת להעריך במהירות את ההשפעות של דיו ביו-חומרים מועמד על הכדאיות והפנוטיפ (ביטוי קולטן פני השטח) של תאי התורן היא יתרון רב, במיוחד לפני הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של רקמות מורכבות המכילות סוגי תאים שונים המוטמעים במטריצה של הביוינק, שהיא יקרה וגוזלת זמן רב.

הגישה של פרוטוקול זה כוללת כת BMMCs, דוגמה של תאי פיטום ראשוניים, על פני השטח של מצעים ביו-סינק הידרוג'ל מועמד מראש (1-12.5% CNC מוטבע אגרוז), המאפשר אחזור קל של BMMCs לניתוח מאוחר יותר של כדאיות התא וביטוי קולטן פני השטח על ידי ציטומטריית זרימה. בידוד של מח עצם מעצם הירך של העכבר ואת השוקה דורש דיוק ותשומת לב לפרטים בשל שבריריות וגודל קטן של עצמות אלה. לאחר בידוד מוצלח ותצהיר של מח העצם למדיום תרבית התאים, חיוני לשמור על תרבית התא עם 30 ng/ mL עכבר רקומביננט IL-3 ברציפות במשך 4 שבועות, אשר מבטיח גירוי מתמשך כדי להבדיל את תאי אבות hematopoietic לתאי פין כי הם חיוביים כפול עבור קיט (CD117) וקולטני משטח תא FcεRI.

ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי פיטום עבור ביטוי פני השטח של קולטני קיט (CD117) ו- FcεRI צריך להשתמש בבקרות נוגדנים איזוטיפ כדי לסייע בהבחנה עם אות רקע לא ספציפי מהאותות הספציפיים של הנוגדנים המשמשים למקד קולטנים אלה, כפי שהוכח באיור 4A(ii), B(ii). זה גם חיוני כדי שער על אוכלוסיית תאי התורן מוגדר היטב כדי לא לכלול פסולת תאים כפי שמוצג איור 4A(i) ו 4B(i), אשר יכול גם לא במיוחד לאגד נוגדנים. יש להשתמש במיקרופיפיט עדין בעת אחזור ה- BMMCs מפני השטח של מצעי הידרוג'ל הביוינק כדי להפחית את כוחות הגיזה המופעלים על התאים, אשר עלולים לפגוע בקרום התא וכתוצאה מכך מכתים באופן מלאכותי עם PI. ה- BMMCs מוכתם PI צריך להיות מנותח על ידי cytometry זרימה מיד לאחר תקופת הדגירה הכתימה מסתיימת כמו המדיום מכתים PI, אשר מבוסס על PBS-0.5% w / v BSA, אינו מיועד לקיים תאים לתקופות ממושכות של זמן מחוץ למדיום תרבית התא. מכיוון ש- PI מחלחל רק לתאים עם קרום תאים שנפרץ, הוא מסוגל להכתים תאים נמקיים עם סלקטיביות גבוהה ורגישות. עם זאת, PI אינו מסוגל לזהות תאים אפופטוטיים, אשר לשמור על קרום התא שלם.

ניתן להגדיל את ההבחנה הציטומטרית של זרימת PI-exctotosion המתוארת בפרוטוקול זה עם Annexin-V-פלואורסצין איזוטיוצינט (FITC), אשר נקשרת באופן ספציפי לפוספוליפיד, פוספטידילסרין, המועבר לעלון החיצוני של קרום התא של תאים אפופוטוטיים. עם זאת, יש צורך בפיצוי כדי להסביר את פליטת הפלואורסצנטיות של FITC לערוץ הגלאי המשמש לרכישת פליטת פלואורסצנטיות מ- PI ולהיפך. בהכנת הביו-הדפסה להדפסה תלת-ממדית מקוד ה-G של לוחית 24-well שסופק, חיוני כי כיול נקודת ההתחלה יבוצע במדויק, לפיו קואורדינטות ה- x וה- y של מרכז ה- D1 היטב נרשמות, וקובץ הקוד G מתעדכן בקואורדינטות x ו- y אלה בקו 1. אם שלבי כיול ראשוניים אלה אינם מבוצעים במדויק, ראשי ההדפסה לא יעברו לנקודת ההתחלה הנכונה בתחילת ההדפסה. כיול נכון של ציר z חשוב באותה מידה כמו כישלון לעשות זאת יכול לגרום זרבובית של ראש ההדפסה מתנגש עם מכונת ההדפסה או צלחת 24-well בתחילת ההדפסה.

התרשים הסכמטי של מבנה הרשת המשעשע 5 x 5 x 1 מ"מ 2 שכבות (איור 5C(iii)), ממחיש את נוכחות הנקבוביות בין חוטי הביו-ינק המובלטים היוצרים את המצע. גודל הנקבוביות וקוטר הסיבים תלויים בשלושה פרמטרים: (i) מהירות הנסיעה של זרבובית ההדפסה, (ii) לחץ ההבלטה המוחל על הביונק בתוך המחסנית, ו- (iii) קוטר זרבובית ההדפסה. ניתן להדפיס מצעים של Bioink עם קטרי חוטים גדולים ונקבוביות קטנות באמצעות מהירות זרבובית הדפסה איטית יותר, לחץ שחול גבוה יותר (>12 kPa) וזרבובית הדפסה בקוטר גדול יותר (22 G). לעומת זאת, מהירות זרבובית הדפסה מהירה יותר, לחץ שחול נמוך יותר (<12 kPa) וזרבובית הדפסה בקוטר קטן יותר (27 G) יביאו למצעים עם חוטים עדינים יותר ונקבוביות גדולות יותר. עם זאת, לחץ שחול גבוה מספיק יגרום גושים עקביים של bioink להיות extruded במקום חוטים רציפים, אשר ישפיע לרעה על איכות ושלמות מבנית של מצע ביוהדפסה 3D.

הביונק המועמד CNC / agarose / D-mannitol המוצג בפרוטוקול זה עובר ג'לציה תרמית כאשר אגרוז מתקרר לטמפרטורת החדר. לעומת זאת, הביו-וינק המסחרי המשמש להדפסה ביולוגית תלת-ממדית בפרוטוקול זה עובר הצלבה יונית עם CaCl2 בשל הכללת נתרן אלגינט בפורמולת הביו-ינק. לכן, יש צורך לטבול את הפיגומים FNC/alginate/D-mannitol המודפסים ביו-מודפסים בתמיסת CaCl2 של 50 מ"מ לאחר הדפסה ביולוגית כדי להקל על הצלבה (ג'לציה) של המצע. השמטה של שלב הקישור היוני עם CaCl2 תגרום לפירוק פיגומי FNC / אלגינט / D-מניטול כאשר הם שקועים במדיום תרבית התא. המגבלה העליונה של ניסוח ביו-ink CNC/אגרוז/D-מניטול ביישום שלה בהדפסת ביו-הדפסה תלת-ממדית בפועל היא טמפרטורת ההיתוך הגבוהה במיוחד של אגרוז (90-95 מעלות צלזיוס). למרות ראשי ההדפסה של ביו-הדפסה 3D המשמש במחקר זה יכול להגיע לטמפרטורה מקסימלית של 130 °C (50 °F), חוטים extrued של CNC / agarose / D-מניטול סביר להתפזר במהירות כמו שכבות רצופות מודפסים כדי לבנות את המצע. מגבלה זו של ניסוח CNC / agarose / D-מניטול ביו-ינק ניתן לעקוף על ידי הדפסת CNC / agarose / D-מניטול bioink ישירות על מכונת הדפסה מקוררת כדי להאיץ ג'לציה, או החלפת אגרוז עם נתרן אלגינט, אשר ניתן לבליט בטמפרטורת החדר ועובר crosslinking יוני מהיר עם 50 mM CaCl2 בתוך 5 דקות.

פרוטוקול זה מציע גישה אמינה למסך במהירות ולא לכלול ניסוחים bioink המציגים תאימות ביוכימית לקויה עם תאים חיסוניים רגישים, כגון תאי פין, כי לא צריך להיות נתון הדפסה ביולוגית 3D שחול פנאומטי. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא חסכוני כפי שהוא דורש כמויות נמוכות יחסית של תאים כדי לבצע בדיקת הקרנה multiplexed. לעומת זאת, תערובות תאי ביו-ינק שפותחו מראש צריכות להיות מודפסות ביולוגית בצפיפות תאים גבוהה מאוד (>107 תאים/מ"ל), מה שיכול להתברר כיקר וגוזל זמן רב כדי לבצע בדיקת סינון תאימות ביולוגית במיוחד כאשר קולטים תאים ראשוניים התלויים בגורמי גדילה רקומביננטיים יקרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר קנדה ואלברטה Innovates.

Acknowledgments

אנו מודים לאלברטה אינחדשס על שסיפקה ל- CNC וקן האריס וג'ה-יאנג צ'ו על העצה הטכנית שלהם בעת הכנת מטריצת CNC / אגרוז / D-מניטול. אנו מודים גם לבן הופמן, הת'ר וינצ'ל וניקול דיאמנטידס על הייעוץ הטכני והתמיכה שלהם עם ההתקנה וכיול הביו-הדפסה התלת-ממדית INKREDIBLE+ .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A
Acetic Acid (glacial) Sigma Aldrich AX0074-6
Agarose (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) Thermo Fisher Scientific 17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) Sigma Aldrich N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) BD 309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in BD 305111
BioLite 24 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 930-186
BioLite 96 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130-191
Biosafety Cabinet Class II Microzone Corp., Canada BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2930-100GM
C
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) Thermo Fisher Scientific 12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) CELLINK LLC IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL CELLINK LLC CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps CELLINK LLC CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC CELLINK LLC Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER CELLINK LLC S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G CELLINK LLC NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G CELLINK LLC NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G CELLINK LLC NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) Sigma Aldrich 11465015001
Centrifuge (Benchtop) Eppendorf 5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate Sigma Aldrich CLS3370
CO2 Incubator Binder GmbH, Germany 9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) Fisher Scientific 44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) Thermo Fisher Scientific 17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated Thermo Fisher Scientific 12484028
FlowJo Software Becton Dickinson & Co. USA Version 10.6.2
G
GraphPad Prism GraphPad Software, LLC Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) VWR 15170-208
HEPES Sodium Salt Fisher Scientific BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT) Sigma Aldrich I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco) Thermo Fisher Scientific 25030-081
Lithium L-lactate Sigma Aldrich L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) Sigma Aldrich M8640
Microtubes (1.7 mL clear) Axygen MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear) Axygen MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) Millipore ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) Thermo Fisher Scientific 725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific 15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)  Thermo Fisher Scientific 10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) Thermo Fisher Scientific 12-4031-82
Recombinant Murine IL-3 PeproTech, Inc.  213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) GE Healthcare SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) Fisher Scientific NC9913213
Sodium Azide, 500 g Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma Aldrich 252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) Sigma Aldrich 93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) Thermo Fisher Scientific VLBL00D0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  3. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
  4. Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
  5. Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
  6. Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
  7. Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
  8. Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
  9. Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
  10. Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
  11. Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
  12. Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
  13. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
  14. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  15. Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
  16. Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
  17. Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 171
ייצור של דיו ביו-חומרים אגרוז משובץ ננו-תאית לגבישית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. … More

Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. B., Kulka, M. Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture. J. Vis. Exp. (171), e62519, doi:10.3791/62519 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter