Summary
Este protocolo destaca um método para avaliar rapidamente a biocompatibilidade de uma nanocelulose cristalina (CNC)/agarose tinta biomaterial de hidrogel composto com células de mastro derivadas da medula óssea em termos de viabilidade celular e expressão fenotípica dos receptores de superfície celular, Kit (CD117) e receptor IgE de alta afinidade (FcεRI).
Abstract
A bioimpressão tridimensional (3D) utiliza compósitos à base de hidrogel (ou tintas biomateriais) que são depositados em um padrão, formando um substrato sobre o qual as células são depositadas. Como muitas tintas biomateriais podem ser potencialmente citotóxias para células primárias, é necessário determinar a biocompatibilidade desses compósitos de hidrogel antes de sua utilização em processos dispendiosos de engenharia de tecidos 3D. Alguns métodos de cultura 3D, incluindo a bioimpressão, exigem que as células sejam incorporadas em uma matriz 3D, dificultando a extração e análise das células para mudanças na viabilidade e expressão biomarcadora sem provocar danos mecânicos. Este protocolo descreve como prova de conceito, um método para avaliar a biocompatibilidade de um composto de agarose incorporado de nanocelulose cristalina (CNC), fabricado em um sistema de cultura de 24 poços, com células de mastro derivadas da medula óssea (BMMCs) usando assins de fluxo citométrico para viabilidade celular e expressão biomarcadora.
Após 18 h de exposição à matriz CNC/agarose/D-mannitol, a viabilidade do BMMC foi inalterada medida pela permeabilidade do iodeto de propídio (PI). No entanto, os BMMCs cultivados no substrato CNC/agarose/D-mannitol pareciam aumentar ligeiramente sua expressão do receptor IgE de alta afinidade (FcεRI) e do receptor de fator de células-tronco (Kit; CD117), embora isso não pareça depender da quantidade de CNC no composto bioink. A viabilidade dos BMMCs também foi avaliada após uma exposição de curso temporal a andaimes de hidrogel que foram fabricados a partir de uma tinta biomaterial comercial composta de nanocelulose fibrilar (FNC) e alginato de sódio utilizando uma bioimpressora de extrusão 3D. Durante um período de 6-48 h, os substratos FNC/alginate não afetaram negativamente a viabilidade dos BMMCs conforme determinado por ensaios de citometria de fluxo e microtiter (XTT e desidrogenase de lactato). Este protocolo descreve um método eficiente para selecionar rapidamente a compatibilidade bioquímica das tintas biomateriais do candidato para sua utilidade como andaimes 3D para semeadura pós-impressão com células de mastro.
Introduction
O recente interesse em sistemas de cultura 3D e bioimpressão 3D tem focado a atenção em hidrogéis e compósitos de hidrogel. Esses compósitos servem como biomimética viscosa, mas porosa, e podem ser compostos de até 99% de teor de água em peso, o que é comparável aos tecidos biológicos1,2,3. Essas características dos compósitos de hidrogel permitem assim o crescimento das células sem afetar sua viabilidade e função. Um desses compostos é a nanocelulose cristalina (CNC), que tem sido usada como material de reforço em compósitos de hidrogel, andaimes celulares no desenvolvimento de implantes biomateriais, e em culturas bidimensionais (2D) e 3D in vitro cell culture4,5. Na maioria das vezes, as matrizes compostas de CNC não são abertamente citotóxicas para células epiteliais córneas humanas6, células epiteliais intestinais7, células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana8, ou células semelhantes a neurônios9. No entanto, a atividade metabólica e a proliferação de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana diminuem em correlação com o aumento da viscosidade dos compósitos de nanocelulose à base de madeira, sugerindo que a composição da matriz deve ser cuidadosamente testada para seus efeitos deletérios nas funções celulares8.
Da mesma forma, a CNC pode induzir respostas inflamatórias em macrófagos após a internalização, o que pode ter sérias consequências nos sistemas de cultura de células imunes 3D10,11. Na verdade, há muito poucos dados disponíveis sobre como a CNC pode influenciar outras respostas de células imunes, particularmente respostas inflamatórias alérgicas que são iniciadas por células de mastro. As células de mastro são leucócitos granulados que expressam o receptor IgE de alta afinidade, FceRI, responsável por ativar respostas inflamatórias a alérgenos. Sua proliferação e diferenciação são o fator célula-tronco dependente (SCF), que liga o receptor de tyrosina, Kit. As células de mastro são derivadas de células progenitoras de medula óssea que entram na circulação e, posteriormente, migram periféricamente para dispersar-se onipresentemente em todos os tecidos humanos12. Como as células de mastro funcionam em um ambiente de tecido 3D, elas são uma célula imune ideal para estudar processos imunológicos em modelos in vitro de tecido 3D. No entanto, até o momento, não há nenhum modelo de tecido 3D in vitro viável contendo células de mastro.
Devido à natureza altamente sensível das células de mastro e sua propensão a obter respostas pró-inflamatórias a estímulos externos, é necessária uma consideração cuidadosa dos constituintes da matriz 3D e o método bioimpressora de introduzir células de mastro no andaime 3D, como discutido mais adiante. Construções teciduais podem ser biofabricadas a partir de duas grandes categorias de biomateriais, ou seja, bioinks e tintas biomateriais. A distinção reside no fato de que os bioinks são compostos de hidrogel carregados de células, enquanto as tintas biomateriais são compósitos de hidrogel que são desprovidos de células, como definido por Groll et al.13,14. Assim, construções 3D impressas com bioinks contêm células pré-incorporadas dentro da matriz de hidrogel, enquanto construções 3D impressas com tintas biomateriais precisam ser semeadas com células pós-impressão. A biofabricação de andaimes de cultura de bioinks/tintas biomateriais à base de hidrogel é mais comumente realizada usando bioimpressores 3D de extrusão, que extrusem a tinta bioink/bioma material por meio de um bico de microescala sob pressão através de um pistão pneumaticamente ou mecanicamente conduzido14. Bioimpressoras de extrusão fabricam andaimes 3D depositando o bioink em padrões transversais 2D que são sequencialmente empilhados uns sobre os outros em uma abordagem "de baixo para cima".
Para ser compatível com a bioimpressão de extrusão, a tinta bioink/biomaterial à base de hidrogel deve possuir propriedades tioxrópicas (desbastação), pelas quais os polímeros de hidrogel constituinte do fluxo de tinta bioink/biomaterial como um fluido através de um bocal de microcanal quando submetido a estresse de cisalhamento, mas revertam para um estado viscoso, semelhante a gel, após a remoção do estresse da tesoura15 . Devido ao seu alto teor de água, os polímeros de bioinks/tintas biomateriais à base de hidrogel devem ser interligados, física ou covalentemente, para manter a arquitetura e a integridade estrutural da estrutura bioimpressora 3D. No caso de bioinks carregados de células, as células são diretamente submetidas a tensões químicas durante o processo de crosslinking. O processo de extrusão de células encapsuladas dentro da matriz de hidrogel bioink também submete as células ao estresse de tesoura, o que pode levar à redução da viabilidade e/ou morte celular. Uma vez que o modelo de tecido 3D tenha sido bioimpresso, é difícil discriminar entre os níveis de citotoxicidade provocados pela própria matriz de hidrogel e os processos de extrusão e crosslinking, respectivamente. Isso é particularmente desafiador no contexto dos andaimes 3D onde as células são pré-incorporadas dentro da matriz de hidrogel, dificultando a remoção das células para análises subsequentes, o que seria prejudicial à viabilidade das células de mastro.
Uma abordagem mais suave para gerar construções de tecido 3D contendo células de mastro envolve a semeadura das células em andaimes de tinta biomaterial porosa pré-impressos a partir de uma suspensão de cultura celular, o que aproveita a capacidade inata das células de mastro de migrar da circulação para tecidos periféricos. Os benefícios dessa abordagem de semeadura celular são duas vezes: (i) as células de mastro não são submetidas a tensões de tesoura e químicas dos processos de extrusão e crosslinking, respectivamente, e (ii) as células podem ser facilmente removidas do andaime 3D após a exposição por lavagem suave para análise sem afetar negativamente sua viabilidade. O benefício adicional de semear e analisar a viabilidade celular das células de mastro em andaimes de hidrogel bioimpresso 3D, em oposição aos discos de hidrogel 2D é que os andaimes hidrogel bioimpressores 3D recapitulam características topográficas microescalas de tecidos in vivo , que não estão presentes em discos hidrogel 2D a granel. Esta abordagem é uma abordagem adequada, rápida e econômica para determinar os efeitos citotóxicos potencialmente catastróficos das matrizes de hidrogel bioink candidatas em células de mastro, bem como outras células imunológicas, antes do investimento em experimentos dispendiosos de engenharia de tecidos 3D.
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Protocol
NOTA: Este protocolo é composto por cinco seções: (1) isolamento da medula óssea do rato e diferenciação de células de mastro derivadas da medula óssea do rato (BMMCs), (2) fabricação de cnc/agarose/d-mannitol hidrogel em um sistema de 24 poços e cultura de BMMCs nos substratos, (3) remoção de BMMCs dos substratos de hidrogel CNC/Agarose/D-mannitol e análise da viabilidade e expressão biomarcadora utilizando citometria de fluxo, (4) Bioimpressão 3D de andaimes de hidrogel a partir de uma nanocelulose fibrilar comercialmente disponível (FNC)/tinta biomaterial composto alginato de sódio, e (5) cultura de BMMCs em andaimes de hidrogel de alginato FNC/sódio e análise da viabilidade usando citometria de fluxo, XTT e desidrogenase de lactato (LDH) de microtirogenase (LDH) microtirogenase.
1. Geração da cultura BMMC
NOTA: Os camundongos foram eutanizados por asfixia por CO2 após anestesia isoflurane. A tíbia e o fêmur foram isolados, e toda a medula óssea foi colhida. Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com o Conselho Canadense de Diretrizes e Políticas de Cuidados com Animais com aprovação do Comitê de Cuidados e Uso animal da Ciência da Saúde para a Universidade de Alberta.
- Prepare o meio de cultura RPMI-1640 completo adicionando os suplementos listados na Tabela 1 às concentrações finais indicadas. Ajuste o pH do médio para 7,4-7,6 usando NaOH, esterilize o filtro usando um filtro de garrafa de uso único (tamanho de poros de 0,2 μm) e armazene a 4 °C no escuro por até 2 meses.
- Obtenha fêmures de camundongos de acordo com os protocolos e procedimentos do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade local.
NOTA: Neste estudo, os fêmures foram isolados de camundongos C57BL/6, mas qualquer cepa pode ser usada se for relevante para o estudo. - Usando uma tesoura, remova a pele e o músculo da articulação do quadril e, em seguida, puxe suavemente o fêmur torcendo ligeiramente para fora do soquete do quadril (Figura 1). Cuidado para não quebrar a cabeça femoral. Corte a tíbia do fêmur na fabella medial usando uma tesoura. Retire a pata cortando um pouco acima do calcâneo e descarte.
- Usando um bisturi, remova a pele e a cartilagem dos pedaços do fêmur e da tíbia. Usando uma tesoura, faça um corte limpo em cada extremidade do fêmur e tíbia, expondo a medula óssea vermelha dentro. Se necessário, remova a fíbula neste momento, mas note que ela pode ajudar na manipulação da tíbia durante a lavagem da medula óssea.
- Prepare uma agulha de 26 G com uma seringa luer-lock de 5 mL e preencha com aproximadamente 5 mL de mídia completa preparada como descrito acima.
NOTA: Neste ponto, o RPMI incompleto sem os aditivos também pode ser usado para economizar em reagentes. - Segurando o fêmur ou tíbia com fórceps, insira a agulha em uma extremidade do osso e pressione suavemente a seringa. Segure o osso sobre um tubo cônico estéril de 50 mL e injete suavemente aproximadamente 5 mL de meio no osso, aplicando alguma pressão. Observe pedaços de medula óssea cair do outro lado do osso como fitas vermelhas finas e no tubo cônico.
- Gire os aspirados e resuspend em meio completo, ou transfira diretamente para um frasco de cultura de tecido estéril T175 cm2 contendo 50 mL de meio RPMI-1640 completo. Mantenha os aspirados em meio RPMI-1640 completo com interleucina recombinante do mouse 30 ng/mL (IL)-3.
- Depois de 1 dia, observe as culturas sob um microscópio leve. A cultura será composta por uma população heterogênea de células de diferentes formas e tamanhos e pedaços ainda maiores de medula óssea. Alimentar culturas celulares adicionando 15 mL de meio fresco a cada 3-5 dias usando o meio RPMI-1640 completo como descrito acima, e garantir que a densidade celular nunca exceda 1 × 106 células/mL. Uma vez por semana, gire as células a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente, resuspenque em meio RPMI-1640 completo fresco e divida 1,4 em 50 mL de média em frascos T175 frescos.
- Após 4 semanas, determine a pureza celular medindo a expressão superficial dos receptores CD117 (Kit) e FceRI por citometria de fluxo como descrito abaixo (seção 3.2).
NOTA: Após 4 semanas, 99% das células devem ser duplamente positivas para CD117 (Kit) e FcεRI. - Com 4 semanas e em diante, mantenha os BMMCs com 20 ng/mL de IL-3 em meio RPMI-1640 completo. Com aproximadamente 6 semanas, as células pararão de se dividir e não precisarão mais de divisão. Alimente as culturas a cada 3-5 dias, pelota as células por centrifugação uma vez por semana, e resuspend em meio RPMI-1640 completo fresco.
2. Fabricação dos substratos de hidrogel CNC/agarose/D-mannitol e cultura BMMC
- Em uma garrafa de vidro, adicione 0,2 g de pó de agarose ao soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) (2% c/v) a um volume final de 10 mL, e ferva por 1 min a 100 °C para dissolver.
- Dissolva 2,5 g de pó CNC em PBS a um volume final de 10 mL para preparar uma mistura de 25% c/v.
- Dissolva 2 g de pó CNC em PBS a um volume final de 10 mL para preparar uma mistura de 20% w/v, e diluir serialmente a mistura de 20% w/v para preparar misturas CNC de 10, 5 e 2% de w/v.
- Aqueça as misturas de 25, 20, 10, 5 e 2% w/v CNC a 37 °C por 10 min (Figura 2A).
- Adicione 0,46 g de D-mannitol à solução agarose quente (4,6% c/v) e dissolva.
- Misture as misturas pré-aquecidas de 25, 20, 10, 5 e 2% w/v CNC-PBS com a solução agarose/D-mannitol em tubos cônicos separados a uma proporção de 1:1 para produzir concentrações finais de CNC de 12,5, 10, 5, 2,5 e 1% w/v nas misturas de hidrogel.
- Trabalhando rapidamente, adicione 500 μL/bem das soluções acima preparadas na etapa 2.6 em quadruplicar a uma placa de cultura de 24 poços, e deixe ficar 30 minutos à temperatura ambiente para facilitar a polimerização (Figura 2B).
- Cuidadosamente camada 1000 μL da suspensão BMMC a uma densidade de 1,1 × 106 células/mL em cima dos substratos de hidrogel com um micropipettor, e evite tocar o gel com a ponta da pipeta, pois isso danificará a superfície do gel e gerará partículas.
- Incubar os BMMCs nos substratos de hidrogel em uma incubadora estéril (5% de CO2, atmosfera umidificada) a 37 °C por 18 h.
3. Análises citométricas de fluxo
- Análise citométrica de fluxo de viabilidade do BMMC via exclusão de PI
- Remova cuidadosamente o meio de cultura contendo BMMCs da parte superior do CNC/agarose/D-mannitol, evitando o gel, e transfira as células para um tubo de microfuça de 1,5 mL.
- Lave os BMMCs duas vezes com PBS (pH 7.4) contendo 0,5% w/v de g de soro bovino albumina a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente, e resuspenque em 180 μL de PBS-0,5% w/v BSA a uma densidade final de 1,5 × 106 células/mL. Transfira as células para uma placa de fundo redondo 96.
NOTA: Esterilize todas as soluções PBS-0,5% w/v BSA duas vezes usando um filtro de seringa do tamanho de um poro de 0,2 μm e armazene a 4 °C. - Adicione 20 μL de PBS-0,5% w/v BSA, ou 10x PI (100 μg/mL) preparado em PBS-0,5% w/v BSA, às células a uma concentração final de 10 μg/mL, e incubar para 1 h a 4 °C ou 15 min em temperatura ambiente no escuro. Adquira dados de fluorescência usando um citômetro de fluxo equipado com um laser de íon argono (488-514 nm) e filtro de bandpass para permitir a detecção de emissão de fluorescência a 578 nm. Adquira 20.000 eventos por amostra a uma taxa de fluxo de 30 μL/min à temperatura ambiente. Analise os dados descritos abaixo (seções 3.2.7-3.2.10).
- Análise citométrica de fluxo de BMMCs para Kit (CD117) e expressão do receptor de superfície FcεRI
- Remova cuidadosamente o meio de cultura contendo BMMCs da parte superior do CNC/agarose/D-mannitol, evitando o gel, e transfira as células para um tubo de microfuça de 1,5 mL.
- Lave bmmcs duas vezes com PBS filtrado-0,5% BSA a 300 × g para 5 min em temperatura ambiente, e resuspend em 180 μL de PBS contendo 0,5% w/v BSA (1,5 × 106 células/mL). Transfira as células resuspended para uma placa de fundo redondo de 96 poços.
- Adicione 20 μL de soluções de trabalho de anticorpos de 10x às células para alcançar uma concentração final de 0,06 μg/mL de CD117 (c-Kit)-phycoerythrin (PE) e 0,06 μg/mL de FcεRIα-alophycocyanin (APC), respectivamente.
NOTA: As soluções de trabalho de anticorpos de 10x devem ser preparadas em PBS esterilizado por filtro-0,5% w/v BSA. - Adicione 20 μL de soluções de trabalho de controle de isótipo de 10x contendo qualquer um dos conjugados isótipo de rato IgG2b κ-PE ou hamster armênio IgG isótipo-APC para separar poços contendo células que não foram manchadas com nenhum dos conjugados anticorpo-fluorohore na etapa 3.2.3.
NOTA: Os controles isótipos, o isótipo de rato IgG2b κ isótipo-PE e o controle do isótipo IgG do hamster armênio-APC servem para controlar a fixação não específica de anticorpos ao BMMC. Como os BMMCs não expressam altos níveis de RFC, raramente há fluorescência de fundo elevada detectada com anticorpos de controle de isótipo. Prepare as soluções de trabalho de controle de isótipo 10x em PBS esterilizado por filtro-0,5% w/v BSA. - Incubar a placa de fundo redondo de 96 poços por 1h a 4 °C no escuro.
- Lave as células adicionando 200 μL de pbs fresco-0,5% w/v BSA buffer para cada poço, e centrífuga a 300 × g por 5 min à temperatura ambiente. Repita o passo de lavagem mais uma vez. Remova cuidadosamente o supernatante sem tocar na pelota celular; deixar para trás algum supernatante para garantir que a pelota celular permanece imperturbável.
- Após a lavagem, resuspend células em 100 μL de 0,5% w/v BSA, 0,05% w/v azida de sódio em PBS (pH 7.4) que foi filtrada duas vezes com um filtro de seringa tamanho poros de 0,2 μm. Adquira dados de fluorescência nos canais do detector PE e APC utilizando um citômetro de fluxo, conforme descrito acima na etapa 3.1.3.
- Analise dados usando software capaz de visualizar e analisar arquivos de dados citométricos de fluxo com a extensão ".fcs".
- Inicie a análise plotando a dispersão para a frente (FSC) ao longo do eixo x e dispersão lateral (SSC) ao longo do eixo y, e portão para a população celular conservada com uma faixa FSC de log10 1.5-5.0 e uma faixa SSC de log10 0.75-3.25 nas células não tratadas e não manchadas, como mostrado na Figura 3A(i),(ii).
NOTA: Isso serve para garantir que detritos celulares com baixos valores FSC e SSC sejam eliminados da análise. As células de mastro são normalmente células muito granulares (SSC) e grandes (altas FSC) quando comparadas a outros tipos de células imunológicas, como monócitos e linfócitos. - Em seguida, gere os perfis de pontos FSC vs. SSC e perfis de histogramas de amostras não tratadas que foram manchadas com os controles de corante, anticorpos ou isótipo, e obtenha intensidade média de fluorescência (MFI) nos canais PE ou APC de acordo com o espectro de emissão do conjugado ou corante específico de anticorpos fluoróforo utilizado. Aplique o mesmo conjunto de portões e parâmetros a todas as amostras de BMMC incubadas com diferentes substratos CNC/Agarose/D-mannitol e manchadas com os controles, anticorpos ou corantes correspondentes; obter MFIs.
NOTA: Essencialmente, os lotes de pontos FSC vs SSC das amostras manchadas não tratadas devem ser indistinguíveis de amostras não tratadas/não manchadas, obtidas na etapa 3.2.9, para garantir que o procedimento de coloração não altere o tamanho da célula (medido pelo FSC) ou a granularidade (medida pelo SSC) (Figura 3A(i)). - Calcular MFIs médios e erro de média (SEM) para cada amostra de 4 experimentos independentes seguidos pela geração de gráficos usando um pacote de software de análise estatística.
- Prepare sobreposições de histograma no software de análise de dados citométricos de fluxo (Figura 3B, 4A(ii),B(ii)).
4.3D Bioimpressão dos substratos de hidrogel de alginato FNC/sódio
NOTA: A bioimpressora 3D utilizada neste estudo é um sistema pneumático-extrusão equipado com dois cabeçotes de impressão independentes controlados pela temperatura. A tinta biomaterial usada para bioimpressão 3D dos andaimes de hidrogel é formulada de (a) nanocelulose fibrilar altamente hidratada (FNC), que é morfologicamente semelhante ao colágeno, (b) alginato de sódio e (c) D-mannitol. É fornecida como uma suspensão de hidrogel estéril em cartuchos de 3 mL aos quais os bocais de bioimpressão estéreis de bioimpressão (22, 25 ou 27 G) podem ser anexados.
- Use este protocolo com os cabeçoteiros e impressos à temperatura ambiente, onde a temperatura ambiente é de 20-25 °C.
- Armazene os cartuchos de tinta de biomateriais a 4 °C para manter a estabilidade do composto de hidrogel. Antes de iniciar a bioimpressão 3D, remova um cartucho (3 mL) da geladeira e permita que ele se equilibre à temperatura ambiente.
- Instalação de um cartucho Bioink na Bioimpressora 3D INKREDIBLE+
- Remova as tampas de extremidade azul do cartucho de tinta biomaterial de 3 mL (Figura 5B(i)) e afixe um bocal de bioimpressão cônica estéril de 22 G (azul) na extremidade do frasco de bloqueio de luer do cartucho Bioink.
NOTA: É essencial fixar o bocal de bioimpressão cônica desejado ao cartucho de bioink antes de instalar o cartucho e realizar as etapas subsequentes de calibração, pois a falha em fazê-lo resultará em calibração inadequada do eixo z da bioimpressora 3D. - Conecte a tubulação de alimentação de pressão de ar para o cabeçoso de impressão 1 (PH1, à esquerda) à extremidade oposta do cartucho e insira o cartucho com o bocal de bioimpressão cônica anexado no slot vertical de PH1 (Figura 5A(ii)).
- A seatir firmemente o cartucho em PH1 com o bocal de bioimpressão cônica estendendo-se abaixo do cabeçoso de impressão. Aperte o parafuso no sentido horário ph1 até que o dedo esteja apertado para travar o cartucho Bioink no lugar. Observe que a bioimpressão 3D pode ser realizada com PH2 deixado vazio.
- Remova as tampas de extremidade azul do cartucho de tinta biomaterial de 3 mL (Figura 5B(i)) e afixe um bocal de bioimpressão cônica estéril de 22 G (azul) na extremidade do frasco de bloqueio de luer do cartucho Bioink.
- Calibrando os eixos x-y-z da bioimpressora 3D
- Ligue a bioimpressora 3D e inicie o software bioimpressora em um PC conectado à bioimpressora 3D através de um cabo USB 2.0.
- No software, clique no botão CONNECT para sincronizar o software com a bioimpressora 3D.
NOTA: A sincronização é bem sucedida quando as luzes de diodo ultravioleta emitindo luz do cabeçotes acendem e desligam, e o ventilador do filtro HEPA é ligado novamente. O software deve ser sincronizado com a bioimpressora 3D antes de colocar os eixos bioimpressoras e a calibração do ponto de partida, conforme descrito nas etapas subsequentes. - Observe quatro opções no menu principal de controle da bioimpressora 3D: (i) PREPARE BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) UTILITIES MENU e (iv) TELA DE STATUS. Selecione a opção PREPARAR BIOPRINT e, em seguida, role para baixo e selecione a opção HOME AXES .
NOTA: A bioimpressora 3D moverá o conjunto de cabeçote para trás e para a esquerda para calibrar os eixos y e x, respectivamente. Depois disso, com os cabeços de impressão pausados na posição mais à esquerda, o bioimpressora aumentará a impressão até que o interruptor de calibração do eixo z (localizado no bloco impresso) faça contato com o bocal de bioimpressão cônico instalado no cabeçote de impressão 1 - Após a calibração bem sucedida dos eixos x-y-z , observe a ligeira redução do impresso e a realocação dos cabeçotas de impressão para acima do ponto central do bloco impresso (Figura 5A(i)).
- Calibração do ponto de partida da bioimpressora para bioimpressão em placas de 24 poços
- Remova uma placa de cultura de 24 poços estéreis de sua embalagem de plástico selada, e marque um ponto do ponto central do poço D1 na parte inferior da placa com um marcador permanente. Retire a tampa da placa e coloque a placa de cultura de 24 poços na impressão com bem D1 localizado no canto esquerdo dianteiro do bloco impresso.
- No menu de controle principal, selecione O MENU UTILITÁRIOS e selecione MOVE AXIS. Mova os cabeçotas de impressão em incrementos de 1 mm ao longo dos eixos x e y até que o bocal de bioimpressão cônica do PH1 esteja diretamente sobre o ponto marcado sob bem D1. Se necessário, ajuste a posição do bocal de bioimpressão cônica sobre o ponto, movendo os cabeçotas de impressão em incrementos de 0,1 mm.
- Registo as coordenadas x e y do bocal de bioimpressão cônica quando diretamente sobre o centro do poço D1, conforme indicado na tela do painel de controle da bioimpressora 3D.
NOTA: No caso da bioimpressora INKREDIBLE+ 3D utilizada aqui, as coordenadas x e y são as seguintes: x : -46,5 e y : -27,5. Estas coordenadas servem como ponto de partida no centro do poço D1 para bioimpressão em uma placa de 24 poços. - Em seguida, levante o bloco de impressão em incrementos de 1 mm até que a parte inferior do poço D1 esteja quase tocando o bocal de bioimpressão cônica instalado no cabeçote de impressão 1. Ajuste o movimento do impresso em incrementos de 0,1 mm, se necessário (Figura 5A(ii)." Em seguida, no MENU UTILITÁRIOS, selecione a opção CALIBRAÇÃO DO EIXO Z e selecione e confirme ainda mais a opção CALIBRAÇÃO STORE Z .
- Retorne ao menu principal e selecione a opção PREPARAR BIOPRINT . Role para baixo e selecione a opção CALIBRATE Z .
NOTA: A bioimpressora 3D agora baixará a impressão impressa ao executar com sucesso a calibração do eixo z (Figura 5A(iii)."
- Atualizando o arquivo G-code de placa de 24 poços com coordenadas corretas de ponto de partida
- Abra o arquivo de código geométrico de placa de 24 poços (G-code) fornecido no software bioimpressora (Arquivo Suplementar 1).
NOTA: Este arquivo de código G de 24 poços codifica a impressão de construções retilineares de 2 camadas 5 x 5 x 1 mm em cada poço (Figura 5C(i),(iii)). Os arquivos de código G fornecidos podem ser usados com qualquer software de bioimpressão 3D. - Observe que a linha 1 do arquivo de código G lê G0 X-50.0 Y-33.5 ; Posição central de D1 bem. Atualize as coordenadas x e y na Linha 1 com os valores obtidos na etapa 4.5.3, ou seja, a Linha 1 deve agora ler G0 X-46.5 Y-27.5 ; Posição central de D1 bem. Salve o arquivo com um novo nome.
NOTA: Este procedimento serve para calibrar o arquivo de código G para que a impressão comece no centro do poço D1 com base nas coordenadas x,y da bioimpressora 3D específica que está sendo usada. Esta abordagem pode ser usada para calibrar o arquivo G-code de placa de 24 poços para impressão com qualquer bioimpressora 3D de extrusão. Para efeitos deste estudo, apenas a metade esquerda da placa de 24 poços, ou seja, poços A1-3, B1-3, C1-3 e D1-3 foram impressos. Um arquivo de código G separado que codifica a impressão de construções retilineares de 2 camadas 5 x 5 x 1 mm em uma grade 3 x 4 também é fornecido (Arquivo Suplementar 2, Figura 5C(ii)).
- Abra o arquivo de código geométrico de placa de 24 poços (G-code) fornecido no software bioimpressora (Arquivo Suplementar 1).
- Ajuste da pressão de extrusão para Printhead 1 (PH1)
- Certifique-se de que a bomba pneumática esteja bem conectada à porta de entrada de ar traseira da bioimpressora 3D INKREDIBLE+ e ligue a bomba pneumática.
- Puxe o botão de controle para a frente localizado no lado direito da bioimpressora INKREDIBLE+ 3D.
NOTA: O botão de controle dianteiro ajusta a pressão para PH1, enquanto o botão de controle traseiro ajusta a pressão para PH2. - Observe os medidores de pressão digital para PH1 e PH2 localizados na frente da bioimpressora cada uma leitura próxima de 0 kPa. Gire lentamente o botão de controle dianteiro no sentido horário até que a pressão indicada no medidor esquerdo para PH1 atinja 12 kPa (Figura 5A(iii)."
- Coloque um papel de tecido dobrado ou um pedaço de filme impermeável, selando sob o bocal de impressão do cartucho instalado, tomando cuidado para não tocar no bocal de impressão.
- No menu de controle principal da bioimpressora 3D, selecione PREPARAR BIOIMPRESS.
- Navegue e selecione ATIVAR O PH1. Note que a tinta biomaterial começa a extrusão do bocal de impressão. Se necessário, aumente a pressão de extrusão girando o botão de controle no sentido horário até que a tinta biomaterial seja extrudada em um filamento contínuo e registe a nova configuração de pressão. Trabalhe rapidamente para evitar o desperdiçondo tinta biomaterial.
- Selecione Desligar o PH1 para impedir a extrusão da tinta biomaterial, remova o papel de tecido ou filme contendo a tinta biomaterial extrudada do bloco impresso e feche a porta da bioimpressora.
NOTA: A bioimpressora 3D ligará automaticamente a fonte de pressão de ar ao PH1 durante a impressão, conforme instruído pelo arquivo de código G.
- Bioimpressão 3D de substratos de hidrogel retilinear em formato de placa de 24 poços
- No menu de controle principal da bioimpressora 3D, selecione UTILITIES MENU. Navegue e selecione DESATIVAR O SD PRINT, que permitirá que o software bioimpressora transmita arquivos de código G para a bioimpressora 3D para impressão.
- Clique no botão LOAD no software bioimpressora e selecione o arquivo de código G de placa de 24 poços atualizado salvo na etapa 4.6.2.
- No painel de controle à direita no software, selecione a guia PRINT PREVIEW e clique no botão IMPRIMIR para iniciar a bioimpressão em D1.
NOTA: Se usar o arquivo de código G da placa G de 3 x 4, a bioimpressão terminará em bem A3 da placa de 24 poços (Figura 5C(ii),D, em oposição ao bem A6 se uma placa completa de 24 poços for impressa. - Após a conclusão da bioimpressão dos construtos retilineares, cubra a placa de 24 poços com sua tampa e mova-a para um armário de biossegurança classe II.
- Mergulhe cada construção retilítila em duas gotas de solução cacl2 estéril de 50 mM (Figura 5B(ii)), e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
NOTA: Isso serve para cruzar ionicamente as cadeias de polímeros de alginato com os íons Ca2+ e permitir que os construtos retilícleos mantenham sua integridade estrutural. - Aspire cuidadosamente a solução CaCl2 de cada construção e enxágue uma vez em 1 mL de 1x PBS (pH 7.4) para remover o excesso de CaCl2 (Figura 5D).
- Para evitar a desidratação dos construtos de hidrogel bioimpresso, mantenha os construtos retilinear 3D bioimpressos em PBS 1x fresco até que os BMMCs estejam prontos para serem semeados nas construções (Figura 5D).
5. Incubação de BMMCs em andaimes retilineares bioimpressos 3D e testes de viabilidade
- Incubação de BMMCs em andaimes de hidrogel retilinear bioimpresso 3D
- Alíquotas de BMMCs nos andaimes retilícleos bioimpressos 3D bioimpressos em triplicado por quatro durações diferentes, por exemplo, 6, 18, 24 e 48 h, de modo que todos os tratamentos terminem simultaneamente. Use BMMCs semeados em poços vazios em triplicado para as mesmas durações que controles não tratados.
- Transfira as BMMCs de um frasco de cultura T175 cm2 para um tubo cônico estéril de 50 mL, e pelota os BMMCs a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente.
- Resuspenque a pelota em 50 mL de meio RPMI completo fresco contendo 20 ng/mL de IL-3, e calcule a densidade celular viva contando uma alíquota de BMMCs manchados de trippan azul usando um hemacytómetro.
- Com base na densidade celular calculada na etapa 5.1.3, prepare uma alíquota de 6 mL da suspensão BMMC a uma densidade final de 1 × 106 células/mL.
- Para a configuração de incubação de 48 horas, aspire PBS dos poços A1-3 contendo os andaimes de hidrogel retilíclear 3D bioimpressos e pipeta 1 mL de BMMC (1 × 106 células/mL) em cada poço. Além disso, a pipeta de 1 mL de BMMC (1 × 106 células/mL) suspensão em poços A4-6 sem construções bioimpressoras para servir como controle não tratado. Incubar os demais poços contendo andaimes bioimpostos (B1-3, C1-3, D1-3) em RPMI sem aditivos para evitar a desidratação até que o tempo adequado seja alcançado para semeadura com BMMC para as durações de tratamento de 24, 18 e 6 horas. Encha os poços sem andaimes bioimpressos (B4-6, C4-6, D4-6) com 1 mL de PBS até que o tempo apropriado seja alcançado para semeadura com os BMMCs para os pontos de tempo de 24, 18 e 6h.
- Incubar a placa de 24 poços a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO2 de 5%.
- Para a configuração de incubação de 24 horas, aspirar a cultura/tampão de cultura pré-existente dos poços B1-6 e a suspensão de 1 mL de BMMC (1 × 106 células/mL) nesses poços. Devolva a placa para a incubadora.
- Para a configuração de incubação de 18 h, aspirar a cultura pré-existente meio/tampão dos poços C1-6 e a suspensão de 1 mL de BMMC (1 × 106 células/mL) nesses poços. Devolva a placa para a incubadora.
- Para a configuração de incubação de 6 h, aspirar a cultura/tampão de cultura pré-existente dos poços D1-6 e a suspensão de 1 mL de BMMC (1 × 106 células/mL) nesses poços. Devolva a placa para a incubadora.
- Para a terminação de incubação, dispense amostras de cada poço da placa de 24 poços para (i) coloração e análise de PI por citometria de fluxo, (ii) ensaio de viabilidade celular XTT e (iii) ensaio de liberação de LDH. Portanto, certifique-se de que uma placa redonda de 96 poços e os tubos de microfugem necessários de 1,5 mL sejam rotulados bem antes do ponto final da incubação.
- Amostragem celular para ensaio metabólico XTT
- Resuspenque minuciosamente os BMMCs no meio de cultura dentro de cada poço, tomando cuidado para não danificar e fragmentar os andaimes de hidrogel bioimpresso 3D.
- Transfisticamente transfira 40 μL da suspensão homogênea do BMMC de cada poço para tubos de microfuge de 1,5 mL contendo 760 μL de meio RPMI completo fresco (volume final = 800 μL), e vórtice brevemente para misturar.
- Dispense 100 μL das suspensões BMMC diluídas em triplicado em uma placa de microtâmmetro de fundo plano de 96 poços que é adequada para registrar medidas de absorção (ver a Tabela de Materiais) em um espectrômetro de microparbramento.
- Dispense 50 μL de solução de trabalho XTT para cada poço contendo a suspensão celular BMMC usando uma micropipette multicanal.
NOTA: Prepare a solução de trabalho XTT misturando 5 mL de reagente XTT com 100 μL de reagente de acoplamento de elétrons. Descongele estes componentes a partir de -20 °C em um banho de água de 37 °C imediatamente antes de usar. - Incubar a placa de 96 poços a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO2 de 5% por 24 h.
- No final da incubação, retire a placa de 96 poços da incubadora e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Registre valores de absorção em um espectrofotômetro de microplape a 450 nm com subtração de fundo a 650 nm.
- Amostragem supernatante para ensaio de desidrogenase de lactato (LDH)
- Transfira as suspensões restantes do BMMC (960 μL) de cada poço da placa de 24 poços para tubos de microfuge, e pelota as células a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente.
- Pipeta três alíquotas de 100 μL da cultura celular supernascida de cada tubo de microfuge em uma placa de fundo plana de 96 poços. Descarte as sobras de supernadentes de cada tubo de microfuge e retenha as pelotas BMMC para mais manchas com PI nas seções 5.4.1-5.4.8.
- Pipeta 50 μL da solução de trabalho LDH em cada alíquota de 100 μL de supernasce.
NOTA: Consulte o arquivo suplementar 3 para a preparação dos reagentes de ensaio LDH. - Incubar por 1h no escuro à temperatura ambiente.
- Pipeta 50 μL de ácido acético de 1 M para cada poço para parar a reação.
- Registre valores de absorção em um espectrofotômetro de microplape a 490 nm com subtração de fundo a 680 nm.
- Análise citométrica de fluxo da viabilidade do BMMC via exclusão de iodeto de propidium (PI)
- Resuspenja as pelotas BMMC no buffer de lavagem de fluxo (PBS [pH 7.4] contendo 0,5% w/v BSA), e pelota as células a 300 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Repita o passo de lavagem com o tampão de lavagem de fluxo mais uma vez.
- Resuspenda cada pelota BMMC em 400 μL de tampão de lavagem de fluxo.
NOTA: Serão 24 amostras de BMMC resuspended no total: 12 amostras de BMMC incubadas em substratos de hidrogel bioimpresso (4 pontos de tempo em triplicado) e 12 amostras de BMMC incubadas em poços sem construções bioimpressas (4 pontos de tempo em triplicado). - Em uma placa de microteter de fundo redondo de 96 poços, pipeta 20 μL de tampão de lavagem de fluxo em poços A1-12 e B1-12. Na mesma placa de microtítiter, pipeta 20 μL de solução de coloração pi 10x (100 μg/mL PI no buffer de lavagem de fluxo) em poços C1-12 e D1-12.
- Dispense 180 μL das 12 amostras de BMMC incubadas em substratos de hidrogel bioimpresso em poços A1-12 (uma amostra por poço). Dispense 180 μL das 12 amostras de BMMC incubadas sem substratos de hidrogel bioimpresso em poços B1-12 (uma amostra por poço). Utilize as amostras de BMMC distribuídas nos poços A1-12 e B1-12 como controles não localizados para cada condição de tratamento (24 controles no total).
- Dispense 180 μL das 12 amostras de BMMC incubadas em construções bioimpressoras em poços C1-12 (uma amostra por poço). Dispense 180 μL das 12 amostras de BMMC incubadas sem construções bioimpressas em poços D1-12 (uma amostra por poço).
NOTA: As amostras de BMMC nos poços C1-12 e D1-12 serão atingidas em uma concentração de PI eficaz final de 10 μg/mL (24 amostras manchadas no total). - Incubar a placa por 1h a 4 °C ou 15 min em temperatura ambiente no escuro.
- Ao final do período de incubação, analise as amostras diretamente da placa de microtâmetro em um citômetro de fluxo, conforme descrito anteriormente na seção 3.1.
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Representative Results
Uma das características mais cruciais de um substrato de tinta ou cultura biomaterial bem-sucedido é o da biocompatibilidade. Primeiramente, o substrato não deve induzir a morte celular. Existem vários métodos citométricos à base de microtúteres e fluxo de quantificação da viabilidade celular e necrose; no entanto, esses métodos não são favoráveis à análise de células incorporadas dentro de uma matriz de hidrogel. Neste protocolo, a limitação acima mencionada é contornada pela semeadura dos BMMCs no substrato de hidrogel ou andaime bioimpresso. Após um período específico de incubação (6-48 h neste estudo), os BMMCs são facilmente colhidos por micropipetting sem a necessidade de interrupção mecânica ou hidrólise do substrato de hidrogel ou andaime bioimpresso, o que de outra forma causaria danos físicos às células. A viabilidade dos BMMCs é então rapidamente analisada usando o método de permeabilidade pi através da citometria de fluxo. Pi é um corante de membrana impermeável que é excluído de células viáveis com membranas celulares intactas e fluoresces apenas após intercalação entre as bases pares de DNA16.
Como tal, apenas células com membranas celulares comprometidas são permeáveis ao PI e, portanto, fluorescem. A análise de permeabilidade de PI não demonstrou alterações na viabilidade do BMMC quando são cultivadas no substrato CNC/agarose/D-mannitol. De fato, nenhuma das concentrações de CNC testadas (até 12,5% c/v) provocou quaisquer efeitos adversos sobre a viabilidade do BMMC em comparação com as BMMCs cultivadas na ausência dos substratos de hidrogel CNC/agarose/D-mannitol (Figura 3B,C). Também é vital que o substrato bioink ou cultura não altere a morfologia das células. Com base no fluxo citométrico FSC vs. Os lotes SSC, o substrato de hidrogel com maior concentração de CNC (12,5% c/v) não alteraram o tamanho nativo (FSC) ou granularidade (SSC) dos BMMCs em comparação com os BMMCs cultivados na ausência dos substratos de hidrogel CNC/agarose/D-mannitol (Figura 3A(i), (ii)).
Outra característica importante de um substrato de tinta ou cultura biomaterial é que ele deve possuir a capacidade de manter a diferenciação e fenótipo das células que suporta. Dois dos biomarcadores mais quintessencial das células de mastro são o receptor IgE de alta afinidade, FcεRI, que facilita as respostas do BMMC aos antígenos e ao receptor do fator celular-tronco, Kit (CD117), que é necessário para a sobrevivência e diferenciação das células de mastro. As células de mastro maduras são definidas pela expressão desses dois receptores de superfície, e para um substrato de bioink para mantê-los na cultura, não deve modificar significativamente a expressão desses dois receptores. O substrato CNC/Agarose/D-mannitol parecia aumentar a expressão fcεri e kit nas concentrações CNC ≥ 2,5% (Figura 4A(iii),B(iii)). Curiosamente, os níveis elevados de expressão fcεri e kit permaneceram relativamente consistentes entre 2,5% e 12,5% de CNC, o que é indicativo de um efeito de planalto e sugere um efeito que não depende da concentração de CNC, mas de algum outro parâmetro do composto de hidrogel.
Os andaimes de tinta bioimpressora bioimpressora bioimpressora 3D gerados neste estudo consistem em nanocelulose fibrilar (FNC), em vez de nanocelulose cristalina, e alginato de sódio como o gelador, em vez de agarose. A nanocelulose fibrilar exibe características topográficas nanoescalas distintas em comparação com a CNC17 que, além da arquitetura de microescala dos substratos de bioink de hidrogel 3D bioimpressionados, poderia afetar potencialmente a viabilidade dos BMMCs. Após a bioimpressão 3D e crosslinking iônico de andaimes de bioink FNC/alginate/D-mannitol (Figura 6), os BMMCs foram cultivados sozinhos ou nos andaimes de hidrogel bioimpresso 3D para 6, 18, 24 e 48 h, respectivamente, a fim de avaliar as mudanças dinâmicas na viabilidade dos BMMCs em resposta aos andaimes FNC/alginate/D-mannitol, se houver, durante longos períodos de tempo. O ensaio XTT indicou que a atividade metabólica dos BMMCs cultivados nos andaimes de hidrogel bioimpresso 3D permaneceu relativamente consistente em ~100% em todos os pontos de tempo testados quando comparados com BMMCs cultivados sozinhos (Figura 7A). A lise das células resulta na liberação do LDH no meio de cultura celular, que o ensaio LDH detecta em função de sua atividade enzimática oxido-redutiva.
Os BMMCs cultivados nos andaimes de hidrogel bioimpresso 3D apresentaram um aumento gradual dependente do tempo na liberação de LDH quando comparados aos BMMCs cultivados sozinhos; no entanto, essa tendência apresentou um desvio padrão não significativo inferior a 9% (Figura 7B). A coloração pi dos BMMCs cultivados nos andaimes de hidrogel bioimpresso 3D não revelou mudanças significativas na viabilidade em comparação com os BMMCs cultivados sozinhos em cada ponto de tempo (Figura 7C). Notavelmente, o MFI de BMMCs manchados de PI cultivados nos andaimes de hidrogel bioimpresso 3D permaneceu relativamente consistente (PI-MFI de 7000) em todos os pontos de tempo e foi semelhante aos BMMCs cultivados nos substratos CNC/Agarose/D-mannitol, que apresentou um PI-MFI consistente de 7000 em todas as concentrações da CNC (2,5-12,5%). Coletivamente, esses dados demonstram que os andaimes de hidrogel FNC/alginate/D-mannitol não afetam negativamente a viabilidade dos BMMCs.
Figura 1: Anatomia da perna do rato, representando a tíbia e o fêmur a partir do qual a medula óssea está isolada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação do substrato de hidrogel CNC/agarose/D-mannitol. (A) Esquema do protocolo de preparação do substrato de hidrogel CNC/Agarose/D-mannitol. (B) Os preparativos cnc/agarose/d-mannitol (0, 1, 2,5, 5, 10 e 12,5% (w/v) CNC em PBS/agarose/D-mannitol) foram carregados em uma placa de 24 poços em quadruplicato como ilustrado. Abreviaturas: PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato; CNC = nanocelulose cristalina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise citométrica de fluxo da viabilidade do BMMC via exclusão de iodeto de propídio após a incubação em substratos CNC/agarose/D-mannitol. Os BMMCs foram removidos dos substratos de hidrogel CNC/agarose/D-mannitol, lavados duas vezes, resuspensados em PBS-0,5% w/v BSA, manchados com PI por 1 h a 4 °C, e analisados por citometria de fluxo (n=4). Um total de 20.000 células por amostra foram adquiridas, incluindo a detecção de emissões de fluorescência de PI no canal pe. A análise dos dados foi realizada utilizando-se o software de análise de citometria de fluxo. (A) A dispersão dianteira (x-eixo) versus dispersão lateral (eixo y) reflete a análise da população celular total do (i) controle não tratado BMMC (0% CNC/agarose/D-mannitol) e (ii) BMMCs cultivados em 12,5% CNC/agarose/D-mannitol, representando a população de células fechadas utilizadas para análise de dados. (B) Perfil de sobreposição de histograma de células fechadas (não manchadas ou manchadas com PI), de BMMCs de controle não tratado (0% CNC/agarose/D-mannitol) e BMMCs cultivados em 12,5% CNC/agarose/D-mannitol. (C) Os BMMCs foram cultivados em diferentes substratos CNC/agarose/D-mannitol (1-12,5% (w/v) CNC) por 18 h, e a viabilidade celular foi determinada pela análise citométrica de fluxo de células manchadas de PI. Representação gráfica de PI MFIs para BMMCs incubados em diferentes substratos CNC/Agarose/D-mannitol (1-12,5% (w/v) CNC) relativos a BMMCs que não foram tratados e manchados com PI. Abreviaturas: BMMCs = células de mastro derivadas da medula óssea; CNC = nanocelulose cristalina; PBS = soro fisiológico tamponado por fosfato; BSA = albumina de soro bovino; PI = iodeto de propidium; PE = ficoerthrin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise citométrica de fluxo da expressão do receptor de superfície celular FcεRI e Kit (CD117). Os BMMCs foram cultivados na ausência ou presença de substratos CNC/Agarose/D-mannitol por 18 h, removidos e analisados para expressão receptora. Os dados são representativos de 4 réplicas. Gráfico de pontos de dispersão dianteira (x-eixo) versus dispersão lateral (eixo y) da população celular total na amostra BMMC não tratada (0% CNC/agarose/D-mannitol), manchado com (A)(i) o anticorpo de controle de isótipo-APC ou (B)(i) o anticorpo de controle de isótipo-PE, e a população de células fechadas utilizada para análise de dados. Perfis de sobreposição de histograma de BMMCs fechados (manchados com anticorpo de controle de isótipo ou (A)(ii) anticorpo anti-FcεRI-APC ou (B)(ii) anticorpo anti-Kit-PE), incubados sozinhos (0% CNC/agarose/D-mannitol) ou em substratos CNC/Agarose/D-mannitol de 12,5% CNC/Agarose/D-mannitol. Os BMMCs foram cultivados por 18 h em diferentes substratos CNC/Agarose/D-mannitol (1-12,5% (w/v) CNC) seguidos pela análise de expressão do receptor de superfície fcεri e kit, respectivamente, via citometria de fluxo (n=4). Representação gráfica de IMC de BMMCs manchados com (A)(iii) anticorpos anti-FcεRI-APC ou (B)(iii) anticorpos anti-Kit-PE, respectivamente, seguindo a cultura em diferentes substratos CNC/Agarose/D-mannitol (1-12,5% (w/v) CNC) em relação às células não tratadas (0% CNC) e siliadas similarmente. Abreviaturas: CNC = nanocelulose cristalina; APC = aofiliaanina; PE = ficoerthrina; BMMCs = células de mastro derivadas da medula óssea; MFI = intensidades médias de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Equipamento de bioimpressora 3D e materiais de consumo necessários para bioimpressão 5 x 5 x 1 mm de 2 camadas retilídeas hidrogel bioink andaimes em um formato de placa de 24 poços. (A)(i) Uma bioimpressora 3D pneumática-extrusão com a posição de montagem de cabeçote em sua posição de descanso ao completar o homing de seus eixos x-y-z . (A) (ii) Calibração do ponto de partida do cabeçoteiro 1 com um cartucho de bioink instalado e colocação do bocal de impressão diretamente sobre o meio do poço D1 nas dimensões x-y-z . (A) (iii) Posição de PH1 após a calibração do eixo z e a pressão de extrusão do PH1 definida para 12 kPa. (B) (i) Cartucho de bioink (3 mL) contendo formulação de tinta biomaterial NFC/Alginate/D-mannitol. (B) (ii) Dispensador de gotículas de 50 mM CaCl2 solução de crosslinking. (C) (i) Representação esquemática de um layout de impressão a partir de um arquivo de código G codificando a impressão de andaimes de hidrogel bioinque retilinear de 5 x 5 x 5 x 1 mm de 2 camadas em todos os poços de uma placa de 24 poços. (C) (ii) Representação esquemática de um layout de impressão a partir de um arquivo de código G codificando a impressão de andaimes de hidrogel bioinque retilinear de 5 x 5 x 5 x 1 mm de 2 camadas apenas nos poços A1-3, B1-3, C1-3 e D1-3 de uma placa de 24 poços. (C) (iii) Visão expandida do padrão de andaime de hidropardo de bioink retilinear de 5 x 5 x 5 x 1 mm de 2 camadas no programa de corte, Slic3r. (D) Visão superior dos andaimes de hidrogel bioinque 3D real 3D imersos em PBS. Abreviaturas: 3D = tridimensional; PH1 = cabeço à impressão 1; NFC = celulose nanofibrilar; Código G = código geométrico; PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Diagrama esquemático que retrata o fluxo de trabalho da bioimpressão 3D e da cultura BMMC nos andaimes de hidrogel FNC/alginate/D-mannitol. Bioimpressão 3D de andaimes de hidrogel com bioink FNC/Alginate/D-mannitol a partir de um arquivo de código G codificando um padrão de grade de 5 x 5 x 1 mm de 2 camadas, crosslinking dos andaimes de hidrogel com CaCl2 e cultivo de BMMCs nas construções de hidrogel FNC/Alginate/D-mannitol crosslinked. Abreviaturas: 3D = tridimensional; 2D = bidimensional; Código G = código geométrico; FNC = nanocelulose fibrilar; BMMCs = células de mastro derivadas da medula óssea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Ensaios de fluxo citométrico (PI) e microtídeo (XTT e LDH) de viabilidade BMMC após a incubação nos andaimes FNC/alginate/D-mannitol. (A) Dados de ensaio metabólico de proliferação celular (XTT) para BMMCs cultivados em substratos de bioink FNC/Alginate/D-mannitol para 6, 18, 24 e 48 h, respectivamente. Os valores são apresentados como percentual dos dados metabólicos XTT para BMMCs cultivados sozinhos para 6, 18, 24 e 48 h, respectivamente. As barras de erro indicam desvio padrão (n=3). (B) Dados de ensaio de ensaio de enzimas LDH para BMMCs cultivados em andaimes de bioink FNC/Alginate/D-mannitol para 6, 18, 24 e 48 h, respectivamente. Os valores são apresentados como alterações de dobra em relação à enzima LDH liberada apenas por BMMCs cultivadas apenas para 6, 18, 24 e 48 h, respectivamente. As barras de erro indicam desvio padrão (n=3). (C) Dados citométricos de fluxo de BMMCs manchados de PI que foram cultivados sozinhos ou em andaimes de bioingrama FNC/Alginate/D-mannitol para 6, 18, 24 e 48 h, respectivamente. As barras de erro indicam desvio padrão (n=3). Abreviaturas: LDH = lactato desidrogenase; BMMCs = células de mastro derivadas da medula óssea; FNC = nanocelulose fibrilar; PI = iodeto de propidium; MFI = intensidade média de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1.1.1. Garrafa de 500 mL de RPMI (HyClone, GE Healthcare, EUA) |
| 1.1.2. 4 mM L-glutamina (Gibco, Waltham Massachusetts, EUA) |
| 1.1.3. 50 mM β-Mercaptoethanol (Fisher Scientific, Hampton, New Hampshire, EUA) |
| 1.1.4. 1 mM Piruvanato de Sódio (Gibco) |
| Penicilina U/mL 1.100 (Gibco) |
| 1.1.6. 100 μg/mL streptomicina (Gibco) |
| 1.1.7. 0,1 mM MEM aminoácidos não essenciais (Gibco) |
| 1.1.8. 25 mM HEPES (Fisher) |
| 1.1.9. 10% de FBS inativados de calor (Gibco) |
| 1.1.10. 30 ng/mL mouse recombinante IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, Nova Jersey, EUA) |
Tabela 1: Suplementos completos de mídia RPMI-1640.
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Discussion
A fabricação de tecidos biomiméticos 3D requer a amálgama bem sucedida do bioink, que imita componentes da matriz extracelular, com o componente celular para criar análogos fisiológicos de tecidos in vivo . Isso requer o uso de células primárias, e não células transformadas, ao fabricar tecidos biomiméticos fisiológicos. As células imunológicas primárias, como as células de mastro, no entanto, são particularmente suscetíveis a efeitos citotóxicos e alterações fenotípicas que podem ser provocadas pela própria matriz de bioink, que é indesejável. Portanto, a capacidade de avaliar rapidamente os efeitos da tinta biomaterial do candidato na viabilidade e fenótipo (expressão do receptor de superfície) das células do mastro é altamente vantajosa, especialmente antes da bioimpressão 3D de tecidos complexos contendo diferentes tipos de células incorporados dentro da matriz de bioink, que é caro e demorado.
A abordagem deste protocolo envolve a cultura de BMMCs, um exemplo de células primárias de mastro, na superfície de substratos de bioink de hidrogel pré-formado (1-12,5% CNC embutidos em agarose), o que permite a fácil recuperação dos BMMCs para análise subsequente da viabilidade celular e expressão do receptor de superfície por citometria de fluxo. O isolamento da medula óssea do fêmur do rato e da tíbia requer precisão e atenção aos detalhes devido à fragilidade e pequeno tamanho desses ossos. Após o isolamento bem sucedido e a deposição da medula óssea em meio de cultura celular, é essencial manter a cultura celular com 30 ng/mL recombinante de camundongos IL-3 continuamente por 4 semanas, o que garante estimulação sustentada para diferenciar as células progenitoras hematopoiéticas em células de mastro que são duplamente positivas para os receptores de superfície celular Kit (CD117) e FcεRI.
A análise citométrica de fluxo de células de mastro para a expressão superficial dos receptores Kit (CD117) e FcεRI deve empregar controles de anticorpos isótipos para auxiliar na diferenciação de sinal de fundo não específico dos sinais específicos dos anticorpos utilizados para atingir esses receptores, como demonstrado na Figura 4A(ii),B(ii). Também é essencial acionar uma população bem definida de células de mastro para excluir detritos celulares como mostrado nas Figuras 4A(i) e 4B(i), que também podem ligar anticorpos não especificamente. A micropipetagem suave deve ser usada ao recuperar os BMMCs da superfície dos substratos de hidrogel bioink para reduzir as forças de tesoura exercidas sobre as células, o que poderia danificar a membrana celular e resultar em coloração artificialmente elevada com PI. Os BMMCs manchados de PI devem ser analisados por citometria de fluxo imediatamente após o término do período de incubação de manchas, pois o meio de coloração pi, que é baseado em PBS-0,5% c/v BSA, não se destina a sustentar células por longos períodos de tempo fora do meio de cultura celular. Como a PI só permeia células com membranas celulares comprometidas, é capaz de manchar células necróticas com alta seletividade e sensibilidade. No entanto, pi é incapaz de detectar células apoptóticas, que mantêm membranas celulares intactas.
O ensaio citométrico de fluxo de exclusão do PI descrito neste protocolo pode ser aumentado com isothiocnato de fluxo de exclusão de PI (FITC), que se liga especificamente ao fosfolipídeo, fosfatidiloserina, que é translocado para o folheto externo da membrana celular das células apoptóticas. No entanto, a compensação é necessária para explicar a emissão de fluorescência do FITC no canal detector usado para adquirir emissão de fluorescência da PI e vice-versa. Ao preparar a bioimpressora para bioimpressão 3D a partir do código G de placa de 24 poços fornecido, é essencial que a calibração do ponto de partida seja realizada com precisão, pelo qual as coordenadas x e y do centro do poço D1 são registradas, e o arquivo G-code é atualizado com essas coordenadas x e y na linha 1. Se essas etapas iniciais de calibração não forem executadas com precisão, os cabeçoteiros não passarão para o ponto de partida correto no início da impressão. A calibração correta do eixo z é igualmente importante, pois a falha pode resultar no bocal do cabeçose colidir com a placa impressa ou a placa de 24 poços no início da impressão.
O diagrama esquemático do construídor de grade retilinear de 5 x 5 x 5 x 1 mm de 2 camadas (Figura 5C(iii)), ilustra a presença de poros entre os filamentos de bioink extrudados que formam o substrato. O tamanho dos poros e o diâmetro dos filamentos dependem de três parâmetros: (i) a velocidade de viagem do bocal de impressão, (ii) a pressão de extrusão aplicada ao bioink dentro do cartucho, e (iii) o diâmetro do bocal de impressão. Substratos bioink com grandes diâmetros de filamento e poros pequenos podem ser impressos usando uma velocidade mais lenta do bocal de impressão, maior pressão de extrusão (>12 kPa) e bocal de impressão de diâmetro maior (22 G). Por outro lado, uma velocidade mais rápida do bocal de impressão, menor pressão de extrusão (<12 kPa) e um bocal de impressão de diâmetro menor (27 G) resultarão em substratos com filamentos mais finos e poros maiores. No entanto, uma pressão de extrusão insuficientemente alta resultará em grupos inconsistentes de bioink sendo extrudados em vez de filamentos contínuos, o que afetará negativamente a qualidade e a integridade estrutural do substrato bioimpresso 3D.
O bioink candidato cnc/agarose/D-mannitol apresentado neste protocolo sofre gelação térmica quando a agarose esfria até a temperatura ambiente. Em contraste, o bioink comercial utilizado para bioimpressão 3D neste protocolo sofre crosslinking iônico com CaCl2 devido à inclusão de alginato de sódio na formulação de bioink. É necessário, portanto, imergir os andaimes FNC/alginate/D-mannitol bioimpressos em solução CaCl2 de 50 mM após a bioimpressão para facilitar a ligação cruzada (gelação) do substrato. A omissão da etapa de crosslinking iônica com o CaCl2 resultará na dissolução dos andaimes FNC/alginate/D-mannitol quando estiverem imersos no meio de cultura celular. A principal limitação da formulação de bioink CNC/Agarose/D-mannitol em sua aplicação na bioimpressão 3D real é a temperatura de fusão excepcionalmente alta de agarose (90-95 °C). Embora os cabeçotes de impressão da bioimpressora 3D utilizada neste estudo possam atingir uma temperatura máxima de 130 °C, os filamentos extrudados de CNC/agarose/D-mannitol provavelmente se dispersarão rapidamente à medida que camadas sucessivas forem impressas para construir o substrato. Essa limitação da formulação de bioink CNC/Agarose/D-mannitol pode ser contornada pela impressão do bioink CNC/Agarose/D-mannitol diretamente em uma impressão resfriada para acelerar a gelação, ou substituindo a ágarose por alginato de sódio, que pode ser extrudado à temperatura ambiente e sofre rápida ligação iônica com 50 mM CaCl2 dentro de 5 min.
Este protocolo oferece uma abordagem confiável para tela rápida e exclui formulações de bioink que exibem baixa compatibilidade bioquímica com células imunológicas sensíveis, como células de mastro, que não devem ser submetidas à bioimpressão 3D pneumática- extrusão. Além disso, este protocolo é econômico, pois requer quantidades relativamente baixas de células para realizar um ensaio de triagem multiplexada. Em contraste, as misturas pré-formuladas de células bioink precisam ser bioimpressas em densidades celulares muito altas (>107 células/mL), o que pode ser caro e demorado para realizar um teste de triagem de biocompatibilidade especialmente quando a cultura de células primárias que dependem de fatores de crescimento recombinantes caros.
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Disclosures
Este trabalho foi apoiado pelo National Research Council Canada e Alberta Innovates.
Acknowledgments
Agradecemos à Alberta Innovates por fornecer à CNC e Ken Harris e Jae-Young Cho por seus conselhos técnicos ao preparar a matriz CNC/Agarose/D-mannitol. Agradecemos também a Ben Hoffman, Heather Winchell e Nicole Diamantides por seus conselhos técnicos e suporte com a configuração e calibração da bioimpressora INKREDIBLE+ 3D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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