We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF’s) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM’s), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM’s via calcium (Ca2 +) flux mogelijk is.
Hartherprogrammering is een potentieel veelbelovende therapie geworden om een beschadigd hart te herstellen. Door meerdere transcriptiefactoren te introduceren, waaronder Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kunnen fibroblasten worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde cardiomyocyten (iCM’s). Deze iCM’s, wanneer ze in situ worden gegenereerd in een infarcthart, integreren elektrisch en mechanisch met het omringende myocardium, wat leidt tot een vermindering van de littekengrootte en een verbetering van de hartfunctie. Vanwege de relatief lage herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit van de iCM’s blijft de karakterisering van iCM’s een uitdaging. De momenteel gebruikte methoden op dit gebied, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR, richten zich voornamelijk op hartspecifieke gen- en eiwitexpressie, maar niet op de functionele rijping van iCM’s. Getriggerd door actiepotentialen, leidt het openen van spanningsafhankelijke calciumkanalen in cardiomyocyten tot een snelle instroom van calcium in de cel. Daarom is het kwantificeren van de snelheid van calciuminstroom een veelbelovende methode om de cardiomyocytenfunctie te evalueren. Hier introduceert het protocol een methode om de iCM-functie te evalueren door calcium (Ca2 +) flux. Een αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam werd vastgesteld door Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (hierna Myh6-Cre genoemd) te kruisen met Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (hierna Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genoemd) muizen. Neonatale cardiale fibroblasten (NCF’s) van P0-P2 neonatale muizen werden geïsoleerd en in vitro gekweekt, en een polycistronische constructie van MGT werd geïntroduceerd bij NPF’s, wat leidde tot hun herprogrammering naar iCM’s. Omdat alleen succesvol geherprogrammeerde iCM’s de GCaMP3-reporter tot expressie brengen, kan de functionele rijping van iCM’s visueel worden beoordeeld door Ca2 + flux met fluorescentiemicroscopie. Vergeleken met niet-geherprogrammeerde NKK’s vertoonden NCF-iCM’s een significante calciumtransiënte flux en spontane contractie, vergelijkbaar met CM’s. Dit protocol beschrijft in detail de vestiging van muizenstam, isolatie en selectie van neonatale muizenharten, NCF-isolatie, productie van retrovirus voor cardiale herprogrammering, iCM-inductie, de evaluatie van iCM Ca2 + flux met behulp van onze reporterlijn en gerelateerde statistische analyse en gegevenspresentatie. Verwacht wordt dat de hier beschreven methoden een waardevol platform zullen bieden om de functionele rijping van iCM’s voor cardiale herprogrammeringsstudies te beoordelen.
Myocardinfarct (MI) is wereldwijd een ernstige ziekte. Hart- en vaatziekten (CVD’s) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en zijn goed voor ongeveer 18,6 miljoen sterfgevallen in 20191,2. De totale sterfte van CVD’s is de afgelopen halve eeuw afgenomen. Deze trend is echter vertraagd of zelfs gekeerd in sommige onontwikkelde landen1, wat vraagt om effectievere behandelingen van HVZ. Als een van de fatale manifestaties van HVZ is MI goed voor ongeveer de helft van alle sterfgevallen die worden toegeschreven aan HVZ in de Verenigde Staten2. Tijdens de ischemie, met de blokkering van kransslagaders en beperkte toevoer van zowel voedingsstoffen als zuurstof, lijdt het myocardium aan ernstige metabole veranderingen, schaadt het de systolische functie van cardiomyocyten (CMs) en leidt het tot CM-dood3. Talrijke benaderingen in cardiovasculair onderzoek zijn onderzocht om hartletsel te herstellen en de functie van het gewonde hart te herstellen4. Directe hartherprogrammering is naar voren gekomen als een veelbelovende strategie om het beschadigde hart te herstellen en de functie ervan te herstellen5,6. Door de introductie van Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) kunnen fibroblasten in vitro en in vivo worden geherprogrammeerd naar iCM’s, en die iCM’s kunnen het littekengebied verminderen en de hartfunctie verbeteren7,8.
Hoewel hartherprogrammering een veelbelovende strategie is voor MI-behandeling, blijven er een aantal uitdagingen. Ten eerste zijn de herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit niet altijd zo hoog als verwacht. MGT-inducering kan slechts 8,4% (cTnT+) of 24,7% (αMHC-GFP+) van de totale CF’s bereiken die in vitro naar iCM’s moeten worden geherprogrammeerd7, of tot 35% in vivo8, wat de toepassing ervan beperkt. Zelfs met meer factoren geïnduceerd in het systeem, zoals Hand29 of Akt1 / PKB10, is de herprogrammeringsefficiëntie nog steeds nauwelijks bevredigend om in een klinische omgeving te worden gebruikt. Daarom zijn er meer studies nodig die gericht zijn op het verbeteren van de herprogrammeringsefficiëntie op dit gebied. Ten tweede zijn de elektrische integriteit en contractiekenmerken van iCM’s belangrijk voor de efficiënte verbetering van de hartfunctie, maar deze zijn een uitdaging om te evalueren. Momenteel zijn veelgebruikte evaluatiemethoden in het veld, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR van enkele belangrijke CMs-genenexpressie, allemaal gericht op de gelijkenis van iCM’s en CMs, maar niet direct gerelateerd aan de functionele kenmerken van iCM’s. Bovendien hebben die methoden relatief ingewikkelde procedures en zijn ze tijdrovend. Terwijl herprogrammeringsstudies meestal een screening van potentiële herprogrammeringsfactoren omvatten die de rijping van iCM’s bevorderen11, vereist cardiale herprogrammering een snelle en handige methode op basis van de iCM-functie.
CMs openen de spanningsafhankelijke calciumionkanalen op het cytomembraan tijdens elke contracteringscyclus, wat leidt tot een voorbijgaande instroom van calciumion (Ca2 +) van de intercellulaire vloeistof naar het cytoplasma om deel te nemen aan de myofilamentcontractie. Zo’n Ca2+ instroom- en outfluxcyclus is de fundamentele eigenschap van myocardiale contractie en vormt de normale functie van CMs12. Een methode die Ca2+ instroom detecteert, zou dus een mogelijke manier kunnen zijn om de functie van CM’s en CM-achtige cellen, waaronder iCM’s, te meten. Bovendien biedt een dergelijke methode voor iCM’s een andere manier om de efficiëntie van herprogrammering te evalueren.
Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s) zijn ontwikkeld en op grote schaal gebruikt om celactiviteiten aan te geven, met name actiepotentialen. Over het algemeen bestaan GECI’s uit een Ca2 + bindend domein zoals calmodulin en een fluorescerend domein zoals GFP, en GCaMP3 is er een met een hoge affiniteit en fluorescentie-intensiteit. Het fluorescentiedomein van GCaMP3 wordt geactiveerd wanneer de lokale calciumconcentratie wordt gewijzigd13. In dit artikel wordt een muizenstam beschreven die specifiek een GCaMP3-verslaggever in Myh6+ cellen tot expressie brengt. Door MGT te introduceren in de geïsoleerde NCF’s van pasgeborenen van deze stam, kan de herprogrammering worden gevolgd door fluorescentie, die met succes geherprogrammeerde iCM’s zal vertonen. Zo’n muizenstam en -methode zal een waardevol platform bieden om cardiale herprogrammering te onderzoeken.
Het evalueren van de iCM-functie is noodzakelijk voor het cardiale herprogrammeringsveld. In dit manuscript beschrijft het protocol een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J muizenstam die is vastgesteld, hoe de NPF’s geïsoleerd uit de neonatale muizen in deze stam te gebruiken voor de herprogrammering naar iCM’s, en de evaluatie van de iCM-functie door Ca2+ flux. Dit is een de novo methode om de functionele rijping van iCM’s te evalueren.
Versc…
The authors have nothing to disclose.
We waarderen de inspanningen van Leo Gnatovskiy bij het redigeren van de Engelse tekst van dit manuscript. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) van de Verenigde Staten (1R01HL109054) subsidie aan Dr. Wang.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |