In-vitro-Beurteilung der kardialen Reprogrammierung durch Messung des kardialspezifischen Calciumflusses mit einem GCaMP3-Reporter

Summary

Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den Calcium(^Ca2+)-Fluss ermöglicht.

Abstract

Die kardiale Reprogrammierung ist zu einer potenziell vielversprechenden Therapie zur Reparatur eines beschädigten Herzens geworden. Durch die Einführung mehrerer Transkriptionsfaktoren, einschließlich Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), können Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umprogrammiert werden. Diese iCMs, wenn sie in situ in einem infarktierten Herzen erzeugt werden, integrieren sich elektrisch und mechanisch in das umgebende Myokard, was zu einer Verringerung der Narbengröße und einer Verbesserung der Herzfunktion führt. Aufgrund der relativ geringen Reprogrammierungseffizienz, Reinheit und Qualität der iCMs bleibt die Charakterisierung von iCMs eine Herausforderung. Die derzeit in diesem Bereich verwendeten Methoden, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunzytochemie und qPCR, konzentrieren sich hauptsächlich auf die kardialspezifische Gen- und Proteinexpression, nicht aber auf die funktionelle Reifung von iCMs. Ausgelöst durch Aktionspotentiale führt das Öffnen spannungsgesteuerter Calciumkanäle in Kardiomyozyten zu einem schnellen Zustrom von Calcium in die Zelle. Daher ist die Quantifizierung der Rate des Kalziumeinstroms eine vielversprechende Methode zur Bewertung der Kardiomyozytenfunktion. Hier stellt das Protokoll eine Methode zur Bewertung der iCM-Funktion durch Calcium (^{Ca2 +}) -Fluss vor. Ein αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-Mausstamm wurde durch Kreuzung von Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (unten als Myh6-Cre bezeichnet) mit Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (unten als Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Mäuse etabliert. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs) von P0-P2-Neugeborenenmäusen wurden isoliert und in vitro kultiviert, und eine polycistronische Konstruktion von MGT wurde in NCFs eingeführt, was zu ihrer Reprogrammierung auf iCMs führte. Da nur erfolgreich reprogrammierte iCMs GCaMP3-Reporter exprimieren, kann die funktionelle Reifung von iCMs durch ^Ca2+- Fluss mit Fluoreszenzmikroskopie visuell beurteilt werden. Im Vergleich zu nicht reprogrammierten NCFs zeigten NCF-iCMs einen signifikanten transienten Kalziumfluss und eine spontane Kontraktion, ähnlich wie CMs. Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Etablierung von Mausstämmen, die Isolierung und Selektion neonataler Mäuseherzen, die NCF-Isolierung, die Produktion von Retroviren zur kardialen Reprogrammierung, die iCM-Induktion, die Auswertung des iCM ^Ca2+- Flusses unter Verwendung unserer Reporterlinie sowie die damit verbundene statistische Analyse und Datenpräsentation. Es wird erwartet, dass die hier beschriebenen Methoden eine wertvolle Plattform bieten werden, um die funktionelle Reifung von iCMs für kardiale Reprogrammierungsstudien zu bewerten.

Introduction

Myokardinfarkt (MI) ist weltweit eine schwere Erkrankung. Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) sind weltweit die häufigste Todesursache und für rund 18,6 Millionen Todesfälle im Jahr 20191 ^{verantwortlich,2}. Die Gesamtmortalität von CVDs ist im letzten halben Jahrhundert zurückgegangen. Dieser Trend wurde jedoch in einigen unterentwickelten Ländern verlangsamt oder sogar ^umgekehrt1, was eine wirksamere Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen erfordert. Als eine der tödlichen Manifestationen von CVD macht MI etwa die Hälfte aller Todesfälle aus, die auf CVDs in den Vereinigten Staaten zurückzuführen ^sind2. Während der Ischämie, mit der Blockierung der Koronararterien und der begrenzten Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff, erleidet das Myokard schwere metabolische Veränderungen, beeinträchtigt die systolische Funktion von Kardiomyozyten (CMs) und führt zum CM-Tod3. Zahlreiche Ansätze in der Herz-Kreislauf-Forschung wurden erforscht, um Herzverletzungen zu reparieren und die Funktion des verletzten Herzens ^{wiederherzustellen4}. Die direkte kardiale Reprogrammierung hat sich als eine vielversprechende Strategie zur Reparatur des geschädigten Herzens und zur Wiederherstellung seiner Funktion ^{herausgestellt5,6}. Durch die Einführung von Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) können Fibroblasten in vitro und in vivo auf iCMs umprogrammiert werden, und diese iCMs können den Narbenbereich reduzieren und die Herzfunktion ^{verbessern7,8}.

Obwohl die kardiale Reprogrammierung eine vielversprechende Strategie für die MI-Behandlung ist, gibt es noch eine Reihe von Herausforderungen. Erstens sind die Reprogrammierungseffizienz, Reinheit und Qualität nicht immer so hoch wie erwartet. Die MGT-Aufforderung kann nur 8,4% (cTnT+) oder 24,7% (αMHC-GFP+) der gesamten CFs erreichen, die in vitro7 auf iCMs umprogrammiert werden sollen7, oder bis zu 35% in ^vivo8, was ihre Anwendung einschränkt. Selbst mit mehr im System induzierten Faktoren wie ^Hand29 oder Akt1/^PKB10 ist die Reprogrammierungseffizienz immer noch kaum zufriedenstellend, um in einem klinischen Umfeld eingesetzt zu werden. Daher sind in diesem Bereich weitere Studien erforderlich, die sich auf die Verbesserung der Reprogrammierungseffizienz konzentrieren. Zweitens sind die elektrische Integrität und die Kontraktionseigenschaften von iCMs wichtig für die effiziente Verbesserung der Herzfunktion, aber diese sind schwierig zu bewerten. Derzeit konzentrieren sich weit verbreitete Bewertungsmethoden auf diesem Gebiet, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunzytochemie und qPCR der Expression einiger wichtiger CMs-Gene, alle auf die Ähnlichkeit von iCMs und CMs, aber nicht direkt mit den funktionellen Eigenschaften von iCMs. Darüber hinaus haben diese Methoden relativ komplizierte Verfahren und sind zeitaufwendig. Während Reprogrammierungsstudien in der Regel ein Screening potenzieller Reprogrammierungsfaktoren beinhalten, die die Reifung von iCMs ^fördern11, erfordert die kardiale Reprogrammierung eine schnelle und bequeme Methode, die auf der iCMs-Funktion basiert.

CMs öffnen die spannungsgesteuerten Calciumionenkanäle auf der Zytomembran während jedes Kontraktionszyklus, was zu einem vorübergehenden Zustrom von Calciumionen (^Ca2+) aus der interzellulären Flüssigkeit in das Zytoplasma führt, um an der Myofilamentkontraktion teilzunehmen. Ein solcher ^Ca2+-Ein- und Abflusszyklus ist das grundlegende Merkmal der Myokardkontraktion und bildet die normale Funktion von CMs12. Daher könnte eine Methode, die den ^Ca2+-Zustrom erkennt, eine mögliche Möglichkeit sein, die Funktion von CMs und CM-ähnlichen Zellen, einschließlich iCMs, zu messen. Darüber hinaus bietet eine solche Methode für iCMs eine weitere Möglichkeit, die Reprogrammierungseffizienz zu bewerten.

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) wurden entwickelt und weit verbreitet verwendet, um Zellaktivitäten, insbesondere Aktionspotenziale, anzuzeigen. Im Allgemeinen bestehen GECIs aus einer ^{Ca2 +-} Bindungsdomäne wie Calmodulin und einer Fluoreszenzdomäne wie GFP, und GCaMP3 ist eine mit hoher Affinität und Fluoreszenzintensität. Die Fluoreszenzdomäne von GCaMP3 wird aktiviert, wenn die lokale Calciumkonzentration geändert ^wird13. In diesem Artikel wird ein Mausstamm beschrieben, der speziell einen GCaMP3-Reporter in Myh6+-Zellen exprimiert. Durch die Einführung von MGT in die isolierten NCFs von Neugeborenen dieses Stammes kann die Reprogrammierung durch Fluoreszenz überwacht werden, die erfolgreich reprogrammierte iCMs aufweisen werden. Ein solcher Mausstamm und eine solche Methode wird eine wertvolle Plattform bieten, um die kardiale Reprogrammierung zu untersuchen.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren und Praktiken mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care & Use Committee der University of Michigan genehmigt. Alle experimentellen Verfahren und Praktiken mit Zellkultur müssen BSL2 Biological Safety Cabinet unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Für die Verfahren und Praktiken im Zusammenhang mit Viren wurde die Richtlinie zur ordnungsgemäßen Entsorgung von transfizierten Zellen, Pipettenspitzen und Röhrchen befolgt, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu…

Representative Results

Der experimentelle Workflow zur Erzeugung des Mausstamms Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 und die Genstruktur der transgenen Mäuse ist in Abbildung 1 dargestellt. Während der Mausstamm etabliert ist, wurden die Herzen der Welpen isoliert und unter einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um den Genotyp zu bestätigen. Herzen mit korrektem Genotyp zeigen ca2+-Fluss synchronisiert mit schlagen, visualisiert als GCaMP3-Fluoreszenz, während in Kontrollherzen keine F…

Discussion

Die Bewertung der iCMs-Funktion ist für das Kardiale Reprogrammierungsfeld notwendig. In diesem Manuskript beschreibt das Protokoll einen Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J Mausstamm, der etabliert wurde, wie die ncFs, die von den neonatalen Mäusen in diesem Stamm isoliert wurden, für die Reprogrammierung auf iCMs und die Bewertung der iCMs-Funktion durch ^Ca2+- Fluss verwendet werden. Dies ist eine De-novo-Methode zur Bewertung der funktionellen Reifung von iCMs.

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Materials

15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-70C
50mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-49A
6 Well Cell Culture Plates	Alkali Scientific	TP9006
A83-01	Stemgent	04–0014
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X800E	Inverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Thermo Fisher Scientific	BP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-049-101	Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2	Thermo Fisher Scientific	NC9693955
Counting Chamber	Thermo Fisher Scientific	02-671-51B	Hemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	11960069
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)	Thermo Fisher Scientific	04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)	Thermo Fisher Scientific	E478-500
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025092
IMDM media	Thermo Fisher Scientific	12440053
IX73 Inverted Microscope	Olympus	IX73P2F	Inverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11-668-019
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Medium 199, Earle's Salts	Thermo Fisher Scientific	11150059
MidiMACS Separator and Starting Kits	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore Sigma	SLHV033RB
MM589			Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31-985-070
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	Cell Biolabs	RV-101
pMx-puro-MGT	Addgene	111809
Poly(ethylene glycol)	Millipore Sigma	P5413-1KG	PEG8000
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G
PTC-209	Sigma	SML1143–5MG
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803
Recombinant Human IGF-I	Peprotech	100-11
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
ST 16 Centrifuge Series	Thermo Fisher Scientific	75-004-381
Sterile Cell Strainers	Thermo Fisher Scientific	22-363-547	40 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture Dishes	Thermo Fisher Scientific	FB012921
TE Buffer	Thermo Fisher Scientific	12090015
Trypan Blue solution	Millipore Sigma	T8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365