Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).
A reprogramação cardíaca tornou-se uma terapia potencialmente promissora para reparar um coração danificado. Ao introduzir múltiplos fatores de transcrição, incluindo Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados em cardiomiócitos induzidos (iCMs). Esses iCMs, quando gerados in situ em um coração infartado, integram-se eletricamente e mecanicamente com o miocárdio circundante, levando a uma redução no tamanho da cicatriz e uma melhora na função cardíaca. Devido à eficiência, pureza e qualidade relativamente baixa da reprogramação dos iCMs, a caracterização dos ICMs continua sendo um desafio. Os métodos atualmente utilizados neste campo, incluindo citometria de fluxo, imunocytoquímica e qPCR, concentram-se principalmente na expressão genética e proteína específica do coração, mas não na maturação funcional dos ICMs. Desencadeada por potenciais de ação, a abertura de canais de cálcio fechados com tensão em cardiomiócitos leva a um rápido fluxo de cálcio na célula. Portanto, quantificar a taxa de influxo de cálcio é um método promissor para avaliar a função cardiomiócito. Aqui, o protocolo introduz um método para avaliar a função do ICMS por fluxo de cálcio (Ca2+). Uma cepa de rato αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 foi estabelecida cruzando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referido como Myh6-Cre abaixo) com gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo). Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) de camundongos neonatais P0-P2 foram isolados e cultivados in vitro, e uma construção policistrônica de MGT foi introduzida aos NCFs, o que levou à sua reprogramação para iCMs. Como somente os iCMs reprogramados com sucesso expressarão o repórter GCaMP3, a maturação funcional dos iCMs pode ser avaliada visualmente pelo fluxo Ca2+ com microscopia de fluorescência. Em comparação com os NCFs não reprogramados, os NCF-iCMs apresentaram fluxo transitório de cálcio significativo e contração espontânea, semelhante aos CMs. Este protocolo descreve em detalhes o estabelecimento da cepa do camundongo, isolamento e seleção de corações de camundongos neonatais, isolamento de NCF, produção de retrovírus para reprogramação cardíaca, indução de ICMS, avaliação do fluxo de ICMS Ca2+ utilizando nossa linha de repórteres, e análise estatística relacionada e apresentação de dados. Espera-se que os métodos aqui descritos forneçam uma plataforma valiosa para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs para estudos de reprogramação cardíaca.
O infarto do miocárdio (MI) é uma doença grave em todo o mundo. As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte no mundo e respondem por aproximadamente 18,6 milhões de mortes em 20191,2. A mortalidade total de DCV diminuiu ao longo do último meio século. No entanto, essa tendência tem sido desacelerada ou até mesmo revertida em alguns países não desenvolvidos1, o que exige tratamentos mais eficazes dos DCV. Como uma das manifestações fatais da DCV, o MI é responsável por cerca de metade de todas as mortes atribuídas aos DCV nos Estados Unidos2. Durante a isquemia, com o bloqueio das artérias coronárias e o fornecimento limitado de nutrientes e oxigênio, o miocárdio sofre alterações metabólicas graves, prejudica a função sistólica dos cardiomiócitos (CMs), e leva à morte de CM3. Inúmeras abordagens na pesquisa cardiovascular têm sido exploradas para reparar lesões cardíacas e restaurar a função do coração ferido4. A reprogramação cardíaca direta surgiu como uma estratégia promissora para reparar o coração danificado e restaurar sua função5,6. Ao introduzir Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados para iCMs in vitro e in vivo, e esses iCMs podem reduzir a área da cicatriz e melhorar a função cardíaca7,8.
Embora a reprogramação cardíaca seja uma estratégia promissora para o tratamento de MI, ainda há uma série de desafios. Em primeiro lugar, a eficiência, pureza e qualidade da reprogramação nem sempre são tão altas quanto o esperado. O indução MGT só pode atingir 8,4% (cTnT+) ou 24,7% (αMHC-GFP+) do total de CFs a serem reprogramados para iCMs in vitro7, ou até 35% in vivo8, o que limita sua aplicação. Mesmo com mais fatores induzidos no sistema, como Hand29 ou Akt1/PKB10, a eficiência de reprogramação ainda é pouco satisfatória para ser usada em um ambiente clínico. Assim, mais estudos focados na melhoria da eficiência de reprogramação são necessários neste campo. Em segundo lugar, as características de integridade elétrica e contração dos ICMs são importantes para a melhoria eficiente da função cardíaca, mas estas são desafiadoras de avaliar. Atualmente, métodos de avaliação amplamente utilizados no campo, incluindo citometria de fluxo, imunocitoquímica e qPCR de algumas expressões fundamentais de genes de CMs, estão todos focados na similaridade de iCMs e CMs, mas não diretamente relacionados com as características funcionais dos ICMs. Além disso, esses métodos têm procedimentos relativamente complicados e são demorados. Enquanto os estudos de reprogramação geralmente envolvem uma triagem de potenciais fatores de reprogramação que promove a maturação do ICMs11, a reprogramação cardíaca exige um método rápido e conveniente baseado na função iCMs.
Os CMs abrem os canais de íons de cálcio fechados de tensão no citomembano durante cada ciclo de contração, o que leva a um fluxo transitório de íon de cálcio (Ca2+) do fluido intercelular ao citoplasma para participar da contração do miofilamento. Tal fluxo ca2+ e ciclo outflux é o traço fundamental da contração do miocárdio e constitui a função normal dos CMs12. Assim, um método que detecta o fluxo de Ca2+ pode ser uma maneira potencial de medir a função de CMs e células semelhantes a CM, incluindo iCMs. Além disso, para os ICMs, tal método fornece outra forma de avaliar a eficiência da reprogramação.
Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para indicar atividades celulares, especialmente potenciais de ação. Geralmente, os GECIs consistem em um domínio de ligação Ca2+ , como calmodulin, e um domínio fluorescente como o GFP, e o GCaMP3 é um com alta afinidade e intensidade de fluorescência. O domínio de fluorescência do GCaMP3 será ativado quando a concentração local de cálcio for alterada13. Neste artigo, uma cepa de rato que expressa especificamente um repórter GCaMP3 em células Myh6+ é descrita. Ao introduzir o MGT nos NCFs isolados dos recém-nascidos desta cepa, a reprogramação pode ser monitorada por fluorescência, que irá exibir com sucesso iCMs reprogramados. Tal cepa e método do rato fornecerá uma plataforma valiosa para investigar a reprogramação cardíaca.
Avaliar a função iCMs é necessário para o campo de reprogramação cardíaca. Neste manuscrito, o protocolo descreve uma cepa de camundongos Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J linhagem de camundongos que foi estabelecida, como usar os NCFs isolados dos camundongos neonatais nesta cepa para a reprogramação para iCMs, e a avaliação da função iCMs por ca2+ flux. Trata-se de um método de novo para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs.
<p class="jove_con…The authors have nothing to disclose.
Agradecemos os esforços de Leo Gnatovskiy na edição do texto em inglês deste manuscrito. A Figura 1 foi criada com BioRender.com. Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) dos Estados Unidos (1R01HL109054) para o Dr. Wang.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |