Summary
Presentert her er en protokoll for å kvantifisere og produsere dynamiske bilder av mesenchymal stamcelle (MSC) mediert regulering av makrofag (MΦ) fagocytose av ikke-opsoniserte gjær (zymosan) partikler som er konjugert til et pH-følsomt fluorescerende molekyl.
Abstract
Mesenchymale stamceller (MSC) har tradisjonelt blitt studert for deres regenerative egenskaper, men nylig har deres immunregulatoriske egenskaper vært i forkant. De samhandler med og regulerer immuncelleaktivitet. Fokuset i denne studien er MSC-regulering av makrofagsfagsfaglig fagocytisk aktivitet. Makrofag (MΦ) fagocytose er en viktig del av den medfødte immunsystemresponsen på infeksjon, og mekanismene som MSC modulerer denne responsen gjennom, er under aktiv undersøkelse. Presentert her er en metode for å studere MΦ fagocytose av ikke-opsoniserte zymosan partikler konjugert til en pH-sensitiv fluorescerende molekyl mens i samkultur med MSC. Etter hvert som fagocytisk aktivitet øker og de merkede zymosiske partiklene er omsluttet av det sure miljøet i fagoclysosomet, øker fluorescensintensiteten til det pH-sensitive molekylet. Med passende eksitasjons- og utslippsbølgelengder måles fagocytisk aktivitet ved hjelp av et fluorescerende spektrofotometer og kinetiske data presenteres som endringer i relative fluorescerende enheter over en 70 minutters periode. For å støtte disse kvantitative dataene visualiseres endringen i fagocytisk aktivitet ved hjelp av dynamisk avbildning. Resultater ved hjelp av denne metoden viser at NÅR du er i samkultur, forbedrer MSC MΦ fagocytose av ikke-opsonisert zymosan av både naiv og IFN-γ behandlet MΦ. Disse dataene legger til den nåværende kunnskapen om MSC-regulering av det medfødte immunforsvaret. Denne metoden kan brukes i fremtidige undersøkelser for å avgrense de underliggende cellulære og molekylære mekanismene fullt ut.
Introduction
Mesenchymale stamceller (MSC) er stamceller som gir opphav til bindevevsceller. MSC er til stede i voksen pattedyrvev og kan isoleres fra benmargen1. På grunn av deres immunmodulerende egenskaper studeres disse cellene mye2. Tidlige studier fokusert på MSC regulering av T-celler3,4,5,6 men mer nylig, deres regulering av makrofagceller (MΦ), en viktig cellulær komponent av medfødt immunitet, har fått økt oppmerksomhet7,8,9,10,11,12,13,14 . Betydningen av MSC-MΦ interaksjon i behandlingen av inflammatorisk sykdom understrekes av det faktum at uttømming av monocytter / makrofager avviker de terapeutiske effektene av MSC i dyremodeller8. Her er fokuset cellekontaktinteraksjonen til MSC med MΦ. MSC har kapasitet til å regulere fenotypen til MΦ ved å fremme overgangen fra inflammatoriske til antiinflammatoriske responser, noe som fører til vevsreparasjonsaktiviteter8,9,10,11, og mye er gjort for å demonstrere disse regulatoriske mekanismene. Under andre omstendigheter kan MSC støtte eller forverre en MΦ-drevet inflammatorisk respons12,13 og forbedre MΦ fagocytisk aktivitet14,15. Det er imidlertid en kritisk mangel på eksisterende data som identifiserer mekanismene der og forholdene som MSC regulerer MΦ fagocytisk aktivitet under.
MΦ har familier av reseptorer som gjenkjenner enten opsonisert (antistoff eller komplementert belagt) eller ikke-opsoniserte patogener som fører til fagocytose16. Aktiveringen og aktiviteten til sistnevnte er mindre godt studert17. I et ikke-inflammatorisk in vitromiljø forbedrer MSC MΦ fagocytose av ikke-opsoniserte patogener13. Imidlertid kan anerkjennelse av ikke-opsoniserte patogener av MΦ reduseres etter eksponering for et inflammatorisk miljø produsert av lymfocytter under en adaptiv immunrespons. IFN-γ, utgitt av naturlige morderceller og effektorlymfocytter, har en hemmende effekt på MΦ fagocytose av ikke-opsoniserte partikler18. En samkulturmodell ble utviklet for å studere mekanismene for MSC direkte kontaktregulering av MΦ fagocytose. Målet med eksperimentet som presenteres her er å avgjøre om MSC regulerer MΦ fagocytose av ikke-opsoniserte patogener etter at MΦ har blitt utsatt for IFN-γ (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle medium forberedelses- og cellekulturteknikker utføres under aseptiske forhold ved hjelp av et biosikkerhetsskap med laminær strømning. Alle kulturinkubasjonstrinn som er beskrevet, utføres ved hjelp av en inkubator designet for å opprettholde en atmosfære på 37 °C, 5 % CO2og 95 % fuktighet.
1. Cellekultur
- Forberedelse av vekstmedium
- For MSC og LADMAC, tilsett 50 ml FBS og 5 ml 100x antibiotika/antimykotisk blanding til 500 ml høy glukose DMEM.
- For MΦ, tilsett 50 ml FBS, 100 ml LADMAC tilstandsmedium (tilberedt ved å følge trinnene i pkt. 1.2), og 5 ml 100x antibiotikablanding til 500 ml høy glukose DMEM.
MERK: LADMAC-celler produserer kolonistimulerende faktor (CSF-1) som er nødvendig for å støtte veksten av MΦ-cellene.
- Fremstilling av LADMAC betinget medium
- For å frø LADMAC celler fra frossen bestand, legg til 19 ml vekstmedium fra seksjon 1.1 i hver av de fem T75 cm2 cellekulturbehandlede kolber og plasser i cellekulturinkubatoren i 15 minutter for å likevekte til 37 °C.
- I mellomtiden, rask tine en aliquot av 106 frosne celler ved å inkubere i en 37 °C vannbad i 2-3 min eller til den blir tint. Legg cellene til 9 ml fersk MSC vekstmedium i en 15 ml eller 50 ml sterilt konisk rør og sentrifuger ved 125 x g i en svingende bøtterotor i 5 minutter.
- Aspirer eller dekanter supernatanten, tilsett 5 ml friskt vekstmedium, og rør forsiktig opp og ned for å resuspendere cellepellet.
- Tilsett 1 ml celleoppheng til hver av de fem T75 cm 2-kolbeene ved hjelp av en steril serologisk pipette og plasser dem i cellekulturinkubatoren.
- Hver 2-3 dager legger du til ytterligere 10 ml middels over en 7-10-dagers periode. Samle deretter cellene og supernatanten i sterile 50 ml koniske rør ved hjelp av en steril serologisk pipette og sentrifuge ved 125 x g i 5 minutter.
- Skill supernatanten fra cellepelleten og sterilfilteret supernatanten ved hjelp av en 0,2 μm steril engangsvakuumfilterenhet.
- Fjern aspiratorenheten fra pakken og koble til ved hjelp av vakuumrør til aspiratorpumpen. Hell supernatanten i topprommet og sett på dekselet igjen. Slå på aspiratorpumpen for å filtrere inn i det nederste rommet.
- Forbered aliquots ved å pipettere inn i 50 ml sterile koniske rør og lagre ved -20 °C.
- For å fryse cellepellet, resuspend i frysemedium ved 106 celle / ml, plasser i en frysebeholder, og legg dem deretter i en -80 °C fryser. Etter 24 timer overføres til LN2-lagring.
- Forplante celler som forberedelse til samkultur
- For å frø MSC- og MΦ-celler fra den frosne bestanden, likevekt 9 ml passende vekstmedium tilberedt i seksjon 1.1 i hver av de fire 100 mm cellekulturbehandlede rettene for hver celletype og plasser i cellekulturinkubatoren i 15 min.
- I mellomtiden, raskt tine aliquots av 106 frosne celler ved å inkubere dem i en 37 °C vannbad i 2-3 min eller til bare tint. Tilsett deretter de tinte MSC-cellene til 9 ml ferskt MSC-vekstmedium og tilsett de opptinte MΦ-cellene til 9 ml fersk MΦ-vekstmedium på 15 eller 50 ml sterile koniske rør og sentrifuge ved 125 x g i svingende bøtterotor i 5 minutter.
- Aspirer eller dekanter supernatanten og resuspend hver pellets i 4 ml av riktig frisk vekstmedium ved å forsiktig pipettere opp og ned. Tilsett 1 ml celleoppheng i hver av de fire 100 mm-rettene for hver celletype som er likevektet i trinn 1.3.1.
- Returner oppvasken med celler til inkubatoren. Bytt medium hver 2-3 dager til 70% -80% confluent.
2. Frø MSC i eksperimentelle retter, Dag 1
MERK: Før du sår MSC, må du designe det eksperimentelle 96-brønns plateoppsettet for fluorescerende spektrofotometri og kammersklie for dynamisk avbildning. For 96-brønnsplaten, flanke eksperimentelle brønner med brønner som inneholder celler, men ikke bruk dem i analysen. Merk minst fire brønner som skal brukes for reagenset blankt (RBL). Se tabell 1 for eksempel 96-brønnsmal og tabell 2 for eksempel en 4-brønns kammerskliemal. Svarte eller hvite 96-brønnsplater med klare bunner anbefales. En 1,5 mm borosilikatglasskammersklie er optimal, men antall kamre kan justeres avhengig av studiedesignet. Et sammendragsflytskjema over metodene nedenfor er inkludert i figur 2.
- Ved 70% -80% samløp, aspirer vekstmediet fra kulturene i 100 mm retter og tilsett 5 ml PBS for å isolere MSC.
- Aspirer PBS, tilsett 2 ml 0,05% trypsin / EDTA, og plasser den i kulturinkubatoren i 3-5 min.
- Etter 3 min, kontroller celleavløsningen ved hjelp av et invertert mikroskop. Hvis cellene er koblet fra, går du videre til neste trinn. Hvis ikke, fortsett inkubasjonen i ytterligere 1-2 min. Ikke inkuber lenger enn 5-6 min.
- Tilsett 5 ml frisk vekstmedium til parabolen med de frittliggende cellene. Skyll parabolen med trypsin/medium-blandingen og samle cellene i et rent, sterilt konisk rør på 50 ml ved hjelp av en steril serologisk pipette.
- Sentrifuge i 5 min ved 125 x g. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml frisk vekstmedium ved å pipette forsiktig opp og ned.
- For å telle cellene, legg til 10 μL av celleopphenget til 30 μL 0,4% trypan blå løsning i et 1,5 ml mikrosenterrør. Deretter pipette 10 μL av blandingen under dekslene av et hemocytometer tellekammer.
- Bruk et invertert eller lyst feltmikroskop, med 10x-målet, telle de unstained (levedyktige) cellene i fire av de 1 mm2 rutene. Beregn cellenummeret ved hjelp av formelen: celler/ml = celleantall/# 1 mm2 kvadrater x fortynningsfaktor x 104.
MERK: I dette eksemplet er antallet 1 mm2 kvadrater telt fire, og fortynningsfaktoren er 4. - Bruk ligningen C1V1 = C2V2 til å beregne og forberede en 1 x 105 celle / ml suspensjon. Forbered 1 ml celle-/ml suspensjon for hver kolonne på 96-brønnsplaten som skal fylles og 0,75 ml for hvert kammer i 4-brønnskammersklie som skal fylles i henhold til platedesignet.
MERK: C1 = celleantall, V1 = hva som beregnes, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 ml. - Bestem V1, trekk den fra ønsket 5,50 ml av det totale volumet for å bestemme volumet på det friske mediet som trengs for å forberede suspensjonen. Tilsett volumet av celler (V1) fra den opprinnelige suspensjonen til volumet av friskt medium for totalt 5,50 ml med 1 x 105 celler / ml.
- Tilsett 100 μL 1 x 105 celle/ml suspensjon til hver brønn på 96-brønnsplaten i henhold til platedesignet ved hjelp av en flerkanals mikropipettor og 530 μL til hver av brønnene i kammerskuffen ved hjelp av en mikropipette i henhold til platedesignet. Inkuber over natten.
MERK: For dette eksperimentet er MSC belagt i kolonne 1, 2, 3 og 6 på 96-brønnsplaten (tabell 1) og brønnene 1 og 2 i 4-brønnskammersklie (tabell 2). Derfor fremstilles minst 5,50 ml av en 1 x 105 celle / ml suspensjon. MΦ ved 80% samløp behandles med inflammatoriske mediatorer samme dag msc er sådd i eksperimentelle plater.
3. Aktiver MΦ med IFN-γ, dag 1
- Klargjør aktiveringsmediet og IFN-γ lager.
- For 200 ml aktiveringsmedium, tilsett 40 mg BSA til 200 ml serumfri høy glukose DMEM og sterilt filter ved hjelp av en 0,2 μm steril engangsvakuumfilterenhet.
- For å forberede 0,1% BSA / PBS, tilsett 20 mg BSA til 20 ml PBS. Virvel som skal oppløses. Bruk et sterilt sprøytefilter på 0,2 μm til å filtrere inn i et rent, sterilt konisk rør på 50 ml.
- Tilsett 1 ml steril 0,1 % BSA/PBS-oppløsning til 100 μg lyofilisert IFN-γ for å oppnå en 100 μg/ml lagerløsning. Oppbevars i 50 μL aliquots ved -20 °C.
- Aktiver MΦ med IFN-γ
- Tilsett 2,5 μL 100 μg/ml IFN-γ lager for hver 1 ml av mediet som trengs. For hver 100 mm tallerken som skal aktiveres, klargjør du 10 ml aktiveringsmedium som inneholder IFN-γ i en konsentrasjon på 250 ng/ml.
- Aspirer vekstmediet fra MΦ-kulturene og erstatt det med 5 ml av aktiveringsmediet uten IFN-γ å skylle.
- Aspirer mediet som brukes til skylling og erstatt det med 10 ml IFN-γ supplert aktiveringsmedium for eksperimentell tallerken og med 10 ml ikke-supplert aktiveringsmedium for kontrollen. Inkuber kulturene i 16-24 timer.
4. Isoler MΦ og forbered samkulturene, dag 2
- Fjern aktiveringsmediet fra MΦ-cellene og erstatt det med 5 ml fersk vekstmedium. Skrap forsiktig med en celleløfter og samle cellene i et 50 ml konisk rør.
- Tell cellene ved hjelp av trypanblå ekskludering og hemocytometri som beskrevet for MSC i, trinn 2.6-2.7.
- Bruk ligningen i trinn 2.8-2.9, lag to separate suspensjoner på 2 x 105 celler / ml, en med celler fra kontrollen og en med celler fra de behandlede MΦ-kulturene.
MERK: Forbered 1 ml celle-/ml suspensjon for hver kolonne på 96-brønnsplaten som skal fylles og 0,75 ml for hvert kammer i 4-brønnskammersklie som skal fylles i henhold til platedesignet. - Aspirer forsiktig mediet fra de eksperimentelle brønnene på 96-brønnsplaten som inneholder MSC. Bruk en flerkanals mikropipette, tilsett 100 μL av de behandlede og kontrollen MΦ celle suspensjoner i de aktuelle eksperimentelle brønnene med og uten MSC i henhold til platedesignet. Inkuber over natten.
- Aspirer forsiktig mediet fra 4-brønns kammersklie som inneholder MSC, og bruk en mikropipette, tilsett 530 μL MΦ cellefjæring til de aktuelle brønnene i henhold til designet. Inkuber over natten.
5. Fagocytoseanalyse, kinetisk fluorescerende 96-brønnsplate lest, Dag 3
- Angi analyseparameterne
- På analysedagen slår du på fluorescerende plateleser og datamaskininnstilt temperaturen på systemet til 37 °C.
- Åpne system Pro-programvaren og sjekk instrumentikonet øverst til venstre for å finne ut om instrumentet er koblet til datamaskinen. Hvis den røde sirkelen med en linje er synlig, klikker du på instrumentikonet og velger instrumentet i popup-vinduet for å opprette forbindelsen.
- Velg Nytt eksperiment for å få tilgang til popup-vinduet For plateoppsetthjelper. Velg Konfigurer innstillinger for anskaffelsepå menyen Oppsett av plate .
- Velg Monokromator fra innstillingsmenyen for den optiske konfigurasjonen. Velg FL (fluorescens) for lesemodus og Kinetic for lesetypen.
- I samme konfigurasjonsvindu, under Kategori, klikker du på Bølgelengder, og deretter setter du båndbredden til 9 nm for eksitasjon og 15 nm for utslipp.
- Sett antall bølgelengdepar til 1. Sett bølgelengdene LM1 til 510 nm for eksitasjon og til 540 nm for utslipp.
- Fortsett gjennom kategoriene, og velg Platetype neste. Velg alternativet som samsvarer med platetypen som brukes.
MERK: Det er viktig at valget samsvarer med platetypen. Lesehøydene stilles inn av systemet i henhold til valget. - Velg deretter Leseområde og fremhev arealet av 96-brønnsplaten som er inkludert i eksperimentell design.
- Velg PMT og optikk, sett PMT-forsterkning til Høy og Blinker per lesing til 6. Merk av i boksen ved siden av Les fra bunnen hvis du bruker en klar bunnplate.
- Velg Tidsberegning og angi intervaller på 10 minutter over en periode på 70 minutter.
- Velg Rist, merk av for Før første lesing , og angi 5 s. Merk av for Mellom leseoperasjoner og angi 3 s. Sett risteintensiteten for både lav og lineær.
- Lukk vinduet. Når vinduet Plateoppsett hjelper dukker opp, velger du Konfigurer plateoppsettet. Fremhev BL-brønnene i platedesignet og klikk på Plate Blank.
- Merk hver av de eksperimentelle radene, klikk Legg til, gi gruppen et navn, og velg deretter en farge.
- Velg Serieunder Tildelingsalternativer under plateutformingen, og definer deretter serien i vinduet, og klikk OK. Gjenta dette for hver gruppe.
- Forbered zymosan suspensjon
- Mens du venter på at systemtemperaturen skal nå 37 °C, må du resuspendere 1 mg zymosanpartikler i 5 ml av levende celleavbildningsmediet.
- Tilsett 1 ml levende celleavbildningsmedium til hetteglasset som inneholder partiklene, og samle dem i et glasskulturrør. Skyll hetteglasset med ytterligere 1 ml bildeløsning og overfør til samme glassrør for å sikre at alle partiklene overføres. Tilsett 3 ml ekstra avbildningsløsning for å oppnå en 0,2 mg/ml partikkelfjæring.
- Virvel med raske pulser i 30-60 s. Bruk deretter en sonde soniker for å sonikere med 60 raske pulser.
MERK: Det er svært viktig å skape en homogen suspensjon av partikler og ikke la suspensjonen sitte for lenge før du legger til de eksperimentelle brønnene. Klumping gjentas raskt. Partikkelen per celletetthet må kanskje optimaliseres avhengig av kilden, behandlingen og tettheten til MΦ som brukes. I studiene som ble presentert, ble konjugerte zymosanpartikler brukt. Konjugert E. coli og S. aureus er imidlertid også tilgjengelig.
- Mens du venter på at systemtemperaturen skal nå 37 °C, må du resuspendere 1 mg zymosanpartikler i 5 ml av levende celleavbildningsmediet.
- Tilsett zymosan og les platen
- Aspirer mediet fra de eksperimentelle brønnene og skyll 1x med 100 μL av levende celleavbildningsløsningen. Skyll RBL-brønnene også med levende celleavbildningsoppløsningen.
- Aspirer levende celleavbildningsløsningen fra eksperimentelle og RBL-brønner og erstatt den med 100 μL av den zymosiske partikkelfjæringen fremstilt i avsnitt 5.2.
- Åpne plateskuffen til den fluorescerende leseren ved hjelp av styreputegrensesnittet. Sett platen, uten lokket, i brettet med A1-brønnen øverst til venstre. Lukk skuffen ved hjelp av styreputen og klikk på den grønne Lese-knappen i toppmenyen.
- Når lesingen er fullført, lagrer du filen i riktig mappe og eksporterer dataene i et regnearkformat ved å klikke Fil og velge Eksporter.
- Beregn gjennomsnittlig ± RELATIV SEM-fluorescens for hver replikeringsgruppe på hvert tidspunkt (10 min, 20 min, 30 min osv.) i regnearket (Tilleggsfil 1) og overfør dataene til grafprogramvare.
- Bruk et linjediagramformat til å presentere dataene og bruke toveis ANOVA (Time x Treatment/MSC som faktorer) etterfulgt av Tukeys multisammenligningstest for å finne forskjeller mellom enkeltgrupper.
MERK: Mens den 96-brønnsplaten som leses pågår, klargjør du den dynamiske bildeplaten for tidsforløpbildeanskaffelse. Forsikre deg om at den dynamiske avbildningen fortsetter med analysen av en eksperimentell brønn om gangen.
6. Fagocytoseanalyse, dynamisk avbildning, dag 3
- Slå på bildesystemet og datamaskinen. Dobbeltklikk for å åpne programvaren. Velg Pro-programmodus.
- Kontroller sceneområdet for å sikre at ingen prøver er til stede, og ingenting hindrer bevegelsen av scenen. Klikk deretter Kalibrer nå.
- Under inkubasjonsmenyen på sidefeltet til høyre merker du av i boksen ved siden av H Unit XL og setter den til 37 °C.
MERK: Vent til inkubert stadium er nesten til temperaturen før du forbereder prøvene for avbildning. - Skyll den første eksperimentelle brønnen med 750 μL bildemedie og erstatt den med 400 μL av den zymosanske partikkelfjæringen som er fremstilt i avsnitt 5.2. La de resterende brønnene ligge i vekstmediet.
MERK: Det kan være nødvendig å virvel og sonikere partikkelfjæringen igjen kort hvis den har avgjort i mer enn 15 minutter. - Plasser lysbildet på det inkuberte stadiet av bildesystemet. Still inn en timer i 10 min.
- Bruk bildeprogramvaren, velg Brightfield under Finn-fanen, og klikk deretter på okularikonet i systemkonfigurasjonsvinduet nedenfor. Når 10x-målet er på plass, bruker du okularet og fokuseringsknappen til å fokusere på cellene.
- Velg Kategorien Anskaffelse, bruk rullegardinmenyen Eksperiment, og velg deretter et sett med bølgelengder som inkluderer EGFP-filtersett for å imøtekomme 509 nm eksitasjon 533 nm utslippsbølgelengder av pH-sensitiv fargestoff.
- Når det er ~ 2 min igjen på timeren, bruk programvaren til å endre målet til 20x ved å klikke på 20x-ikonet i målmenyen.
- Klikk på Kanaler-menyen, velg EGFP-filtre og bruk Eksponering-menyen for å stille eksponeringstiden til 400 ms for å oppdage den pH-sensitive grønne fluoroforen når den er omsluttet av fagfellesosomet.
- Klikk på Live og juster fokuset ved hjelp av fokuseringsknappen.
- Klikk på Stopp for å slå av lyset og merk av i boksen ved siden av eksperimentell innstilling for tidsforløp øverst.
- Velg Autofokusfor programvare på Menyen Fokuseringsstrategi . Fra rullegardinmenyen i Autofokus-menyen velger du Smarte og grove innstillinger for å redusere eksponeringstiden for lys mens autofokusen kjører.
- I Time-Lapse-menyen setter du ønsket antall oppkjøp til 30-60 og intervalltiden til 1 min.
- Etter at tidsforløpparametrene er satt og etter 10 min med tilsetning av partikler til den første brønnen, klikker du på Start eksperiment-knappen for å begynne oppkjøpet.
- Når oppkjøpet er ferdig med å bruke den første eksperimentelle brønnen, gjentar du trinn 6.4-6.12 for hver av de gjenværende eksperimentelle brønnene.
- Lagre alle eksperimentfilene med datoen og parameterne i tittelen i riktig mappe.
- Lukk programvaren. Åpne programvaren på nytt i prosesseringsmodus og eksporter filene i MP4-format ved hjelp av Eksport-menyen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter å ha beregnet gjennomsnittlig ± SEM for hver gruppe til enhver tid, presenteres dataene i linjegrafformat med Y-aksen som relativ fluorescerende intensitet og X-aksen som tid. Supplementary File 1 gir et eksempel på rådata fra en kinetisk lesning av 96-brønnsplaten i regnearkformat.
I denne studien viser de optimale resultatene som presenteres i figur 3A, og tabell 3 at 1) samkultur med MSC forbedrer makrofagens fagocytiske aktivitet, 2) IFN-y-behandling reduserer makrofagens aktivitet, og 3) samkultur med MSC redder delvis MΦ fagocytisk aktivitet. Optimale celletettheter er kritiske i disse studiene, og når MΦ er belagt med for lav tetthet, kan det ikke påvises endringer i fluorescensintensiteten (figur 3B). Figur 3C representerer data fra en studie der MΦ ble belagt med for høy tetthet og fluorescensintensiteten forhøyes raskt i alle grupper, og forskjeller kan ikke ses. De dynamiske bildevideoene bekrefter at fluorescerende intensitetsendringer skyldes fagocytose og ikke forsuring av mediet. De gir også kvalitative data og en visuell fremstilling av frekvensen og omfanget av fagocytisk aktivitet (figur 4).
Figur 1: En illustrasjon som viser det sentrale spørsmålet om dataene som presenteres, som er "Kan MSC gjenopprette den fagocytiske aktiviteten til IFN-γ behandlet MΦ?". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over arbeidsflyten for samkultur og fagocytoseanalyse. En oversikt over arbeidsflyten for kvantitativ og kvalitativ analyse av MΦ fagocytoseaktivitet i samkultur med MSC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative kvantitative data fra kinetisk readdemonstrating optimale og suboptimale resultater. I (A) er data representative for et eksperiment med optimal MΦ-celletetthet, i (B) er data representative for et eksperiment med suboptimal for lav MΦ celletetthet, og i (C) er data representative for et eksperiment med suboptimal for høy MΦ celletetthet. Den relative fluorescensintensiteten målt i relative fluorescerende enheter (RFU) er plottet på Y-aksen, mens tiden er plottet på X-aksen. Legg merke til forskjellene i RFU-utvalget blant optimale og sub-optimale eksperimenter. I A,MSC delvis redde MΦ fagocytisk aktivitet i innstillingen av IFN-γ undertrykkelse over en 70 min periode. RFU presenteres som gjennomsnittlig ± SEM, n = 6. Analysen ble utført ved hjelp av Tukeys multisammenligningstest etter en betydelig toveis ANOVA, Interaksjonseffekt P = 0,0001, Tidseffekt P = 0,0001, og Behandling/MSC-effekt P = 0,0001. Symboler angir resultater av flere sammenligningstester. * = signifikant forskjell mellom MSC/MΦ + IFN- γ vs MΦ + IFN-γ, Ŧ = signifikant forskjell mellom MΦ vs MΦ + IFN-γ, og † = signifikant forskjell mellom MSC/MΦ vs MΦ. Se tabell 3 for detaljerte resultater av multippel sammenligningstester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Dynamiske bildevideoer som gir visuell bekreftelse på den cellespesifikke økningen i fluorescens fra sur aktivering av merkede zymosanpartikler etter inkorporering i MΦ-fagoclysosomet. Innstillinger for tidsforløp ble anskaffet hvert 1 min over en 30 min-periode ved hjelp av en eksponeringstid på 400 ms og EGFP-filtersettet. (A) MΦ i monokultur, (B) MΦ i samkultur med MSC, (C) MΦ behandlet med IFN-γ (250 ng/ml) og (D) MΦ behandlet med IFN-γ (250 ng/ml) i samkultur med MSC. Klikk her for å laste ned denne filen.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| En | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
Tabell 1: Eksempel på 96-brønns platedesign. CBL - Cellen er tom. MSC - frø dag 1; MΦ+ behandlet og MΦ ubehandlet frødag 2; RBL reagens blank lagt på analyse dag 3.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
Tabell 2: Eksempel på 4-brønns kammerskliedesign. MSC - belagt dag 1; MΦ+ behandlet og MΦ ubehandlet belagt dag 2.
| Tukeys test av flere sammenligninger | Mener Diff. | 95,00 % KI diff. | Under terskelen? | Sammendrag | Justert P-verdi |
| 0 minutter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | -3871 | -9495 til 1754 | Nei | Ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 til 6345 | Nei | Ns | 0.9873 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 til 5548 | Nei | Ns | >0.9999 |
| 10 minutter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | -3466 | -9091 til 2159 | Nei | Ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 til 7950 | Nei | Ns | 0.7062 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 til 6617 | Nei | Ns | 0.968 |
| 20 minutter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | -1311 | -6936 til 4314 | Nei | Ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 til 8940 | Nei | Ns | 0.422 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 til 8771 | Nei | Ns | 0.4689 |
| 30 minutter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 384.8 | -5240 til 6010 | Nei | Ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 til 7937 | Nei | Ns | 0.7098 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 til 14350 | Ja | *** | 0.0005 |
| 40 minutter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 2247 | -3377 til 7872 | Nei | Ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4913 | -712,2 til 10537 | Nei | Ns | 0.1101 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 til 22145 | Ja | **** | <0.0001 |
| 50 minutter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 5657 | 32.12 til 11282 | Ja | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4932 | -692,9 til 10557 | Nei | Ns | 0.1079 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 til 24708 | Ja | **** | <0.0001 |
| 60 minutter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 12376 | 6752 til 18001 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 til 14986 | Ja | *** | 0.0002 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 til 30373 | Ja | **** | <0.0001 |
| 70 minutter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 13770 | 8145 til 19395 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 til 17612 | Ja | **** | <0.0001 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 til 32888 | Ja | **** | <0.0001 |
Tabell 3: Detaljert statistisk analyse av dataene presentert i figur 3A. Resultater av Tukeys multisammenligningstester etter en betydelig toveis ANOVA med data presentert i figur 3A.
Tilleggsfil 1: En representativ regnearkfil med rå kinetiske data fra et optimalt eksperiment. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse av fagocytose ved hjelp av biopartikler konjugert til en pH-sensitiv fargestoff er et relativt nytt verktøy som har vist seg fordelaktig i forhold til tradisjonelle fluorescerende merkede partikler12,19,20. Med tradisjonelle fluorescerende merkede partikler er bare sluttpunktanalyse mulig. Deteksjon utføres med fluorescerende mikroskopi og/eller spektrofluormetri etter vask eller slukking av partikler som ikke er tatt opp av fagocytten. Kvantitative data avledet fra spektrofluoremetri har potensial til å oppdage ikke-oppslukte partikler, og bildeanalyse for å kvantifisere bare intracellulære partikler er kjedelig og tidkrevende ved hjelp av tradisjonelle fluorescerende mikroskopisystemer14. Biopartikler konjugert til pH-sensitive fargestoffer fluoresce bare i et surt miljø som fagoclysosome, og derfor er de kjedelige vaske- og slukketrinnene unødvendige14. I tillegg gir pH-sensitive merkede biopartikler fordelen av å gi kinetiske data som ikke lett ville bli anskaffet med FITC eller andre fluoroforkonjugerte biopartikler.
Studier som bruker dette nye verktøyet har benyttet strømningscytometri og/eller bildeplattformer for å generere kvantitativ og kinetisk måling av fagocyttaktivitet19,20,21. Flow cytometri er fordelaktig hvis det er en begrenset fagocytt populasjon eller hvis man er interessert i å sortere for nedstrøms analyser som genetiske skjermer19. MSC er kjent for å regulere MΦ-fenotypen gjennom både direkte kontakt og gjennom løselige faktorer. Foreløpige studier har vist at betinget medium fra MSC undertrykte MΦ fagocytose, og derfor ble denne protokollen designet for å bestemme endringene i MΦ fagocytisk aktivitet mens i direkte samkultur med MSC. Under disse forholdene er spektrofluoremetri for å kvantifisere og dynamisk avbildning for å visualisere og bekrefte fagocytisk aktivitet mest hensiktsmessig.
Kritisk for suksessen til disse metodene er optimalisering av celletetthet. MSC må belagt med en tetthet som gir optimal cellekontakt med MΦ-cellene. MΦ må frøs i mono- og samkulturer med en tetthet som ikke bare gir optimal kontakt, men som også gir optimal fluorescensdeteksjon. For lav tetthet vil føre til lav inkorporering i fagoclysosome og små eller flate endringer i relative fluorescerende enheter (Figur 3B). Hvis MΦ er sådd ved for høy tetthet, øker fagocytose raskt, og påvisning av forskjeller mellom grupper maskeres (Figur 3C). Optimalisering av konsentrasjonen av pH-sensitiv fargestoff merket zymosanpartikler per cellenummer er også kritisk. Foreløpige eksperimenter bør utføres for å optimalisere celletettheten til MSC og MΦ, og antall partikler per MΦ-celle. I tillegg bør disse optimaliseringstrinnene utføres hvis andre merkede biopartikler brukes, for eksempel E. coli eller S. aureus.
Riktig bildebehandlingsmedium er også kritisk. Mediet for begge metodene skal være et bufret medium og bør ikke inneholde fenolrød. Fenolrød vil dempe påvisning av fluorescerende utslipp. Også ethvert tilsetningsstoff eller tilstand som kan surgjøre mediet, vil for tidlig aktivere de merkede partiklene og introdusere forhøyet bakgrunn. Reagenset blank er avgjørende for å identifisere potensiell forsuring av mediet.
Ikke bare kan disse protokollene brukes til å undersøke MSC-regulering av MΦ fagocytose av en rekke pH-sensitive biopartikler, men metoden kan også brukes på en rekke samkulturmodeller som inkluderer nøytrofiler og andre fagocytter. I tillegg, ved å bruke denne modellen, kan molekyler og veier som mistenkes for å være involvert i cellekontaktmediert regulering av makrofag fagocytisk aktivitet, undersøkes via siRNA eller CRISPR mediert nedregulering for å validere eller motbevise mistenkte molekylære mål. Potensielle mål inkluderer vedheftsmolekyler, fagocytiske reseptorer og integrinske molekyler.
Arbeidet med disse metodene vil avdekke ny informasjon om signalmekanismene som ligger til grunn for de økte fagocytiske responsene til MΦ etter cellekontaktinteraksjoner med MSC, og dermed fremme vår forståelse av hvilken rolle MSC spiller for å regulere medfødt immunitet. Studier som disse tar for seg et undervurdert område og vil gi et fullstendig bilde av hvilken innflytelse MSC har på makrofagaktivitet, noe som er nødvendig for en full forståelse av deres rolle i immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NSF Major Research Instrument-mekanismen under tilskuddstall 1626093 og 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D.
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
