Summary
Presenteras här är ett protokoll för att kvantifiera och producera dynamiska bilder av mesenchymala stamcell (MSC) medierad reglering av makrofag (MΦ) fagocytos av icke-opsonized jäst (zymosan) partiklar som är konjugerade till en pH-känslig fluorescerande molekyl.
Abstract
Mesenkymala stamceller (MSC) har traditionellt studerats för deras regenerativa egenskaper, men på senare tid har deras immunregulatoriska egenskaper legat i framkant. De interagerar med och reglerar immuncellaktivitet. Fokus för denna studie är MSC-regleringen av makrofagfagocytisk aktivitet. Makrofag (MΦ) fagocytos är en viktig del av det medfödda immunsystemets svar på infektion, och de mekanismer genom vilka MSC modulerar detta svar är under aktiv undersökning. Presenteras här är en metod för att studera MΦ fagocytos av icke-opsonized zymosan partiklar konjugerad till en pH-känslig fluorescerande molekyl medan i samkultur med MSC. När fagocytisk aktivitet ökar och de märkta zymosanpartiklarna innesluts i den sura miljön i phagolysosomen ökar fluorescensintensiteten hos den pH-känsliga molekylen. Med lämpliga excitations- och emissionsvåglängder mäts fagocytisk aktivitet med hjälp av en fluorescerande spektrofotometer och kinetiska data presenteras som förändringar i relativa fluorescerande enheter under en 70-minuters period. För att stödja dessa kvantitativa data visualiseras förändringen i den fagocytiska aktiviteten med hjälp av dynamisk avbildning. Resultat med denna metod visar att när i samkultur, MSC förbättra MΦ fagocytos av icke-opsonized zymosan av både naiva och IFN-γ behandlad MΦ. Dessa data bidrar till den nuvarande kunskapen om MSC-reglering av det medfödda immunsystemet. Denna metod kan tillämpas i framtida undersökningar för att helt avgränsa de underliggande cellulära och molekylära mekanismerna.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC) är stamceller som ger upphov till bindvävsceller. MSC finns i vuxna däggdjursvävnader och kan isoleras från benmärgen1. På grund av deras immunmodulerande egenskaper studeras dessa celler allmänt2. Tidiga studier fokuserade på MSC-reglering av T-celler3,4,5,6 men mer nyligen har deras reglering av makrofagceller (MΦ), en viktig cellulär komponent i medfödd immunitet, fått ökad uppmärksamhet7,8,9,10,11,12,13,14 . Vikten av MSC-MΦ-interaktion vid behandling av inflammatorisk sjukdom understryks av det faktum att utarmning av monocyter/ makrofager upphäver de terapeutiska effekterna av MSC i djurmodeller8. Här är fokus MSC:s cellkontaktinteraktion med MΦ. MSC har kapacitet att reglera fenotypen av MΦ genom att främja övergången från inflammatoriska till antiinflammatoriska svar, vilket leder till vävnadsreparationsaktiviteter8,9,10,11, och mycket har gjorts för att demonstrera dessa regleringsmekanismer. Under andra omständigheter kan MSC stödja eller förvärra ett MΦ-drivet inflammatoriskt svar12,13 och förbättra MΦ fagocytisk aktivitet14,15. Det finns dock en kritisk brist på befintliga data som identifierar de mekanismer varigenom och de förhållanden under vilka MSC reglerar MΦ fagocytisk aktivitet.
MΦ har familjer av receptorer som känner igen antingen opsoniserade (antikropps- eller komplementbelagda) eller icke-opsoniserade patogener som leder till fagocytos16. Aktiveringen och aktiviteten hos den senare är mindre väl studerade17. I en icke-inflammatorisk in vitro-miljö förbättrar MSC MΦ fagocytos av icke-opsoniserade patogener13. Erkännandet av icke-opsoniserade patogener med MΦ kan dock minskas efter exponering för en inflammatorisk miljö som produceras av lymfocyter under ett adaptivt immunsvar. IFN-γ, som frigörs av naturliga mördarceller och effektorlymfocyter, har en hämmande effekt på MΦ-fagocytos av icke-opsoniserade partiklar18. En samkultur modell utvecklades för att studera mekanismerna för MSC direkt kontakt reglering av MΦ fagocytos. Målet med experimentet som presenteras här är att avgöra om MSC reglerar MΦ fagocytos av icke-opsoniserade patogener efter att MΦ har utsatts för IFN-γ (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla medelpreparat- och cellodlingstekniker utförs under aseptiska förhållanden med hjälp av ett biosäkerhetsskåp med laminärt flöde. Alla odlade inkubationssteg som beskrivs utförs med hjälp av en inkubator utformad för att upprätthålla en atmosfär på 37 °C, 5% CO2och 95% fuktighet.
1. Cellkultur
- Förberedelse av tillväxtmedium
- För MSC och LADMAC, tillsätt 50 ml FBS och 5 ml 100x antibiotika/antimykotisk blandning till 500 ml hög glukos DMEM.
- För MΦ, tillsätt 50 ml FBS, 100 ml LADMAC-tillståndsmedium (beredd enligt stegen i avsnitt 1.2) och 5 ml 100x antibiotikablandning till 500 ml DMEM med hög glukos.
OBS: LADMAC-celler producerar kolonistimulerande faktor (CSF-1) som är nödvändig för att stödja tillväxten av MΦ-cellerna.
- Beredning av LADMAC konditionerat medium
- Tillsätt 19 ml tillväxtmedium från punkt 1.1 i var och en av de fem T75 cm 2-cellsodlingsbehandlade kolvarna för att tillsätta 19 ml tillväxtmedium från avsnitt 1.1 i var och en av de fem T75 cm 2-cellsodlingsbehandlade kolvarna och placera i cellodlingskuvösen i 15 minuter för att balansera till 37 °C.
- Under tiden tina snabbt en alikvot på 106 frusna celler genom att inkubera i ett 37 °C vattenbad i 2-3 min eller tills det tinas. Tillsätt cellerna till 9 ml färskt MSC-tillväxtmedium i ett 15 ml eller 50 ml sterilt koniskt rör och centrifugera vid 125 x g i en svängande hinkrotor i 5 min.
- Aspirera eller dekantera supernatanten, tillsätt 5 ml färskt tillväxtmedium och rör försiktigt upp och ner för att återanvända cellpelleten.
- Tillsätt 1 ml cellfjädring till var och en av de fem T75 cm 2-kolvarna med en steril serologisk pipett och placera dem i cellodlingskuvuvösen.
- Var 2-3 dagar, lägg till ytterligare 10 ml medium under en 7-10-dagarsperiod. Samla sedan cellerna och supernatanten i sterila 50 ml koniska rör med en steril serologisk pipett och centrifug vid 125 x g i 5 min.
- Separera supernatanten från cellpelleten och sterilt filtrera supernatanten med hjälp av en 0,2 μm steril vakuumfilterenhet för engångsbruk.
- Ta bort asspiratorenheten från förpackningen och anslut med vakuumrör till aspiratorpumpen. Häll supernatanten i det övre facket och byt ut locket. Slå på asspiratorpumpen för att filtrera in i det nedre facket.
- Förbered alikvoter genom pipettering i 50 ml sterila koniska rör och förvara vid -20 °C.
- För att frysa cellpelleten, återanvänd den i frysmedium vid 106 celler/ml, placera den i en frysbehållare och placera dem sedan i en frys på -80 °C. Efter 24 timmar, överför till LN2 lagring.
- Sprida celler som förberedelse för samkultur
- För att så MSC- och MΦ-celler från det frysta beståndet, balansera 9 ml lämpligt tillväxtmedium som bereds i avsnitt 1.1 i var och en av de fyra 100 mm cellodlingsbehandlade rätterna för varje celltyp och plats i cellodlingsinkubatorn i 15 min.
- Under tiden tinar du snabbt alikvoterna på 106 frusna celler genom att inkubera dem i ett vattenbad på 37 °C i 2-3 minuter eller tills de bara tinat. Tillsätt sedan de tinade MSC-cellerna till 9 ml färskt MSC-tillväxtmedium och tillsätt de tinade MΦ-cellerna till 9 ml färsk MΦ-tillväxtmedium i 15 eller 50 ml sterila koniska rör och centrifugera vid 125 x g i svängande hinkrotor i 5 min.
- Aspirera eller dekantera supernatanten och återanvänd varje pellet i 4 ml av lämpligt färskt tillväxtmedium genom att försiktigt pipettera upp och ner. Tillsätt 1 ml cellfjädring till var och en av de fyra 100 mm-diskarna för varje celltyp som har balanserats i steg 1.3.1.
- Returnera disken med celler till inkubatorn. Byt medium var 2-3 dagar tills 70%-80% confluent.
2. Frö MSC i experimentella rätter, dag 1
OBS: Innan du sår MSC, designa den experimentella 96-brunnsplattan för fluorescerande spektrofotometri och kammarrutschbanan för dynamisk avbildning. För 96-brunnsplattan, flankera experimentella brunnar med brunnar som innehåller celler men använd dem inte i analysen. Markera minst fyra brunnar som ska användas för reagensämnet (RBL). Se tabell 1 för en mall med 96 brunnar och tabell 2 för ett exempel på en 4-brunnsformatmall för kammaren. Svarta eller vita 96-brunnsplattor med klara bottnar rekommenderas. En 1,5 mm borosilikatglaskammarerutschbana är optimal, men antalet kammare kan justeras beroende på studiens design. Ett sammanfattande flödesschema över de metoder som följer ingår i figur 2.
- Vid 70%-80% sammanflöde, aspirera tillväxtmediet från kulturerna i 100 mm rätter och tillsätt 5 ml PBS för att isolera MSC.
- Aspirera PBS, tillsätt 2 ml 0,05% trypsin/ EDTA och placera den i kulturinkubatorn i 3-5 min.
- Kontrollera cellavlossningen efter 3 minuter med hjälp av ett inverterat mikroskop. Om cellerna är fristående fortsätter du till nästa steg. om inte, fortsätt inkubationen i ytterligare 1-2 min. Inkubera inte längre än 5-6 min.
- Tillsätt 5 ml färskt tillväxtmedium till skålen med de fristående cellerna. Skölj skålen med trypsin/mediumblandningen och samla cellerna i ett rent, sterilt koniskt rör på 50 ml med en steril serologisk pipett.
- Centrifugera i 5 min vid 125 x g. Aspirera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 10 ml färskt tillväxtmedium genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- För att räkna cellerna, tillsätt 10 μL av cellupphängningen till 30 μL av 0,4% trypan blå lösning i ett 1,5 ml mikrocentrifugerör. Pipettera sedan 10 μL av blandningen under täckslipet i en hemocytometerräkningskammare.
- Använd ett inverterat eller ljust fältmikroskop, med 10x-målet, räkna de oförstörda (livskraftiga) cellerna i fyra av de 1 mm2 rutorna. Beräkna cellnumret med formeln: celler/mL = cellantal/# 1 mm2 kvadrater x utspädningsfaktor x 104.
OBS: I det här exemplet är antalet 1 mm2 rutor räknade fyra och utspädningsfaktorn är 4. - Använd ekvationen C1V1 = C2V2 för att beräkna för och förbereda en 1 x 105 cell/ml-suspension. Förbered 1 ml cell-/ml-fjädring för varje kolumn på 96-brunnsplattan som ska fyllas och 0,75 ml för varje kammare i 4-brunnskammaren som ska fyllas enligt plåtkonstruktionen.
OBS: C1 = antal celler, V1 = vad som beräknas, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 ml. - Bestäm V1, subtrahera den från önskad 5,50 ml av den totala volymen för att bestämma volymen av det färska mediet som behövs för att förbereda suspensionen. Tillsätt volymen av celler (V1) från den ursprungliga suspensionen till volymen av färskt medium för totalt 5,50 ml med 1 x 105 celler/ml.
- Tillsätt 100 μL 1 x 105 cell/ml-suspension till varje brunn på 96-brunnsplattan enligt plåtdesignen med en flerkanalig mikropipettor och 530 μL till var och en av kamrarnas brunnar med hjälp av en mikropipett enligt plåtdesignen. Inkubera över natten.
OBS: För detta experiment är MSC pläterade i kolumnerna 1, 2, 3 och 6 på 96-brunnsplattan(tabell 1) och brunnarna 1 och 2 i 4-brunnskammarens bild(tabell 2). Därför bereds minst 5,50 ml av en 1 x 105 cell/ml-suspension. MΦ vid 80% sammanflöde behandlas med inflammatoriska medlare samma dag som MSC sås i experimentplattorna.
3. Aktivera MΦ med IFN-γ, dag 1
- Förbered aktiveringsmediet och IFN-γ lager.
- För 200 ml aktiveringsmedium tillsätt 40 mg BSA till 200 ml serumfritt DMEM med hög glukos och sterilt filter med en steril vakuumfilterenhet på 0,2 μm.
- För att förbereda 0,1% BSA/PBS, tillsätt 20 mg BSA till 20 ml PBS. Virvel att lösa upp. Använd ett 0,2 μm sterilt sprutfilter för att filtrera till ett rent, sterilt koniskt rör på 50 ml.
- Tillsätt 1 ml steril 0,1 % BSA/PBS-lösning till 100 μg frystorkad IFN-γ för att uppnå en 100 μg/ml lagerlösning. Förvara i 50 μL alikvoter vid -20 °C.
- Aktivera MΦ med IFN-γ
- Tillsätt 2,5 μL IFN-γ lager per 1 ml ifn-γ för varje 1 ml av det medium som behövs. För varje 100 mm skål som ska aktiveras bereder du 10 ml aktiveringsmedium som innehåller IFN-γ i en koncentration av 250 ng/mL.
- Aspirera tillväxtmediet från MΦ-kulturerna och ersätt det med 5 ml aktiveringsmedium utan att IFN- γ skölja.
- Aspirera det medium som används för sköljning och ersätt det med 10 ml IFN- γ kompletterat aktiveringsmedium för försöksskålen och med 10 ml icke-kompletterat aktiveringsmedium för kontrollen. Inkubera kulturerna i 16-24 h.
4. Isolera MΦ och förbered samkulturerna, dag 2
- Ta bort aktiveringsmediet från MΦ-cellerna och ersätt det med 5 ml färskt tillväxtmedium. Skrapa försiktigt med en celllyftare och samla cellerna i ett 50 ml koniskt rör.
- Räkna cellerna med trypan blå uteslutning och hemocytometri enligt beskrivningen för MSC i steg 2.6-2.7.
- Använd ekvationen i steg 2.8-2.9, förbered två separata suspensioner på 2 x 105 celler/ml, en med celler från kontrollen och en med celler från de behandlade MΦ-kulturerna.
OBS: Förbered 1 ml cell/ml-fjädring för varje kolumn på 96-brunnsplattan som ska fyllas och 0,75 ml för varje kammare i 4-brunnskammaren som ska fyllas enligt plåtkonstruktionen. - Aspirera försiktigt medlet från experimentbrunnarna på 96-brunnsplattan som innehåller MSC. Tillsätt 100 μL av de behandlade och kontroll MΦ-cellupphängningarna i lämpliga experimentbrunnar med och utan MSC enligt plåtkonstruktionen med hjälp av en flerkanalig mikropipett. Inkubera över natten.
- Aspirera försiktigt med medium från 4-brunnskammaren som innehåller MSC och tillsätt med hjälp av en mikropipett 530 μL MΦ-cellsuspension till lämpliga brunnar enligt konstruktionen. Inkubera över natten.
5. Fagocytosanalys, kinetisk fluorescerande 96-brunnsplatta läser, dag 3
- Ange analysparametrarna
- På analysdagen slår du på fluorescerande plattläsare och datorinställ temperaturen på systemet till 37 °C.
- Öppna system Pro-programvaran och kontrollera instrumentikonen i det övre vänstra hörnet för att avgöra om instrumentet är anslutet till datorn. Om den röda cirkeln med en linje är synlig klickar du på instrumentikonen och väljer instrumentet i popup-fönstret för att göra anslutningen.
- Välj Nytt experiment om du vill komma åt popup-fönstret Plate Set-Up Helper. Välj Konfigurera dina förvärvsinställningarpå menyn För registrering av tallriksinställning .
- Välj Monokromator på inställningsmenyn för den optiska konfigurationen. Välj FL (fluorescens) för läsläget och Kinetic för lästypen.
- I samma konfigurationsfönster, under Kategori, klickar du på Våglängderoch ställer sedan in bandbredder till 9 nm för excitation och 15 nm för emission.
- Ställ in antalet våglängdspar till 1. Ställ in våglängderna LM1 till 510 nm för excitation och på 540 nm för utsläpp.
- Fortsätt genom kategorierna och välj Plåttyp härnäst. Välj det alternativ som matchar den plåttyp som används.
OBS: Det är viktigt att valet matchar plåttypen. Läshöjderna ställs in av systemet enligt valet. - Välj sedan Läsområde och markera området på 96-brunnsplattan som ingår i den experimentella designen.
- Välj BETALNING och optik, ställ in PMT-förstärkning till hög och Blinkar per läsning till 6. Markera rutan bredvid Läs nedifrån om du använder en klar bottenplatta.
- Välj Tidsinställning och ställ in för 10 minuters intervall under en 70 min period.
- Välj Skaka, markera rutan Före första läsning och ställ in på 5 s. Markera rutan Mellan läsningar och ställ in på 3 s. Ställ in skakintensiteten för både låg och linjär.
- Stäng fönstret. När fönstret För registrering av plåt ställs in dyker upp väljer du Konfigurera din plåtlayout. Markera BL-brunnarna i plåtdesignen och klicka på Plate Blank.
- Markera var och en av de experimentella raderna, klicka på Lägg till, namnge gruppen och välj sedan en färg.
- Under Tilldelningsalternativ under plåtdesignen väljer du Serieoch definierar sedan serien i fönstret och klickar på OK. Upprepa för varje grupp.
- Förbered zymosan suspensionen
- I väntan på att systemtemperaturen ska nå 37 °C, återanvänd 1 mg zymosanpartiklar i 5 ml av det levande cellavbildningsmediet.
- Tillsätt 1 ml levande cellavbildningsmedium till injektionsflaskan som innehåller partiklarna och samla dem i ett glasodlingsrör. Skölj injektionsflaskan med ytterligare 1 ml bildlösning och överför till samma glasrör för att säkerställa att alla partiklar överförs. Tillsätt 3 ml extra avbildningslösning för att uppnå en partikelupphängning på 0,2 mg/ml.
- Virvel med snabba pulser i 30-60 s. Använd sedan en sond sonicator för att sonikera med 60 snabba pulser.
OBS: Det är mycket viktigt att skapa en homogen suspension av partiklar och inte låta suspensionen sitta för länge innan den läggs till de experimentella brunnarna. Klumpar återkommer snabbt. Partikeln per cell densitet kan behöva optimeras beroende på källa, behandling och densitet av MΦ som används. I de studier som presenterades användes konjugerade zymosanpartiklar. Konjugerade E. coli och S. aureus finns dock också tillgängliga.
- I väntan på att systemtemperaturen ska nå 37 °C, återanvänd 1 mg zymosanpartiklar i 5 ml av det levande cellavbildningsmediet.
- Tillsätt zymosan och läs plattan
- Aspirera mediet från experimentbrunnarna och skölj 1x med 100 μL av livecellsavbildningslösningen. Skölj även RBL-brunnarna med den levande cellavbildningslösningen.
- Aspirera på den levande cellavbildningslösningen från experiment- och RBL-brunnar och ersätt den med 100 μL av den zymosanspartikelsuspension som framställs i avsnitt 5.2.
- Öppna lysrörsfacket på den fluorescerande läsaren med hjälp av pekplattans gränssnitt. Ställ plattan, utan lock, i brickan med A1-brunnen i det övre vänstra hörnet. Stäng facket med pekplattan och klicka på den gröna läsknappen i den övre menyn.
- När läsningen är klar sparar du filen i lämplig mapp och exporterar data i kalkylbladsformat genom att klicka på Arkiv och välja Exportera.
- Beräkna medelvärdet ± SEM relativ fluorescens för varje replikerad grupp vid varje tidpunkt (10 min, 20 min, 30 min, etc.) i kalkylbladet(Kompletterande fil 1) och överför data till grafprogramvara.
- Använd ett linjediagramformat för att presentera data och tillämpa tvåvägs ANOVA (Time x Treatment/MSC som faktorer) följt av Tukeys multipla jämförelsetest för att bestämma skillnader mellan enskilda grupper.
OBS: Medan 96-brunnsplattan pågår, förbered den dynamiska bildplattan för tidsfördröjningsbildförvärv. Se till att den dynamiska avbildningen fortskrider med analysen av en experimentell brunn i taget.
6. Fagocytosanalys, dynamisk avbildning, dag 3
- Slå på bildsystemet och datorn. Dubbelklicka för att öppna programvaran. Välj Pro-programläget.
- Kontrollera scenområdet för att säkerställa att inga prover finns och att ingenting hindrar scenens rörelse. Klicka sedan på Kalibrera nu.
- Markera rutan bredvid H Unit XL under inkubationsmenyn till höger och ställ in den på 37 °C.
OBS: Vänta tills det inkuberade stadiet nästan är till temperaturen innan du förbereder proverna för avbildning. - Skölj den första försöksbrunn med 750 μL bildmedium och ersätt det med 400 μL av den zymosanpartikelupphängning som framställs i avsnitt 5.2. Lämna de återstående brunnarna i tillväxtmediet.
OBS: Det kan vara nödvändigt att virvel och sonikera partikel suspensionen igen kort om den har avgjort i mer än 15 min. - Placera bilden på bildsystemets inkuberade stadium. Ställ in en timer på 10 min.
- Använd bildprogrammet, välj Brightfield under fliken Leta upp och klicka sedan på okularikonen i systemets konfigurationsfönster nedan. Med 10x-målet på plats, använd okularet och fokuseringsvredet för att fokusera på cellerna.
- Välj fliken Förvärv, använd rullgardinsmenyn Experiment och välj sedan en uppsättning våglängder som innehåller EGFP-filteruppsättningen för att rymma 509 nm excitation 533 nm emissionsvåglängder för det pH-känsliga färgämnet.
- När det finns ~ 2 min kvar på timern, använd programvaran för att ändra målet till 20x genom att klicka på 20x-ikonen i målmenyn.
- Klicka på kanalmenyn, välj EGFP-filter och använd exponeringsmenyn för att ställa in exponeringstiden till 400 ms för att upptäcka den pH-känsliga gröna fluoroforen när den har inneslutits i phagolysosomen.
- Klicka på Live och justera fokus med hjälp av fokuseringsknappen.
- Klicka på Stopp för att släcka ljuset och markera rutan bredvid den experimentella inställningen Time-lapse högst upp.
- Välj Autofokus påmenyn Fokuseringsstrategi . I listrutan i autofokusmenyn väljer du Smarta och grova inställningar för att minska exponeringstiden för ljus medan autofokusen körs.
- Ställ in önskat antal förvärv på 30-60 i menyn Time-Lapse till 30-60 och intervalltiden till 1 min.
- När tidsfördröjningsparametrarna har ställts in och efter 10 minuters tillsats av partiklar till den första brunnen klickar du på knappen Starta experiment för att börja förvärva.
- När förvärvet är slutfört med hjälp av den första experimentella brunnen, upprepa steg 6.4-6.12 för var och en av de återstående experimentbrunnarna.
- Spara alla experimentfiler med datum och parametrar i titeln i lämplig mapp.
- Stäng programvaran. Öppna programvaran i bearbetningsläge igen och exportera filerna i MP4-format med hjälp av exportmenyn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter beräkning av medelvärdet ± SEM för varje grupp vid alla tidpunkter presenteras data i linjediagramformat med Y-axeln som relativ fluorescerande intensitet och X-axeln som tid. Kompletterande fil 1 ger ett exempel på rådata från en kinetisk läsning av 96-brunnsplattan i ett kalkylbladsformat.
I denna studie visar de optimala resultaten i figur 3Aoch tabell 3 att 1) samkultur med MSC förbättrar makrofagens fagocytiska aktivitet, 2) IFN-y-behandling minskar makrofagens aktivitet och 3) samkultur med MSC räddar delvis MΦ fagocytisk aktivitet. Optimala celltätheter är avgörande i dessa studier, och när MΦ pläteras vid för låg densitet kan förändringar i fluorescensintensiteten inte detekteras (figur 3B). Figur 3C representerar data från en studie där MΦ var pläterad vid för hög densitet och fluorescensintensiteten snabbt höjs i alla grupper och skillnader inte kan urskiljas. De dynamiska bildvideorna bekräftar att fluorescerande intensitetsförändringar beror på fagocytos och inte försurning av mediet. De ger också kvalitativa data och en visuell representation av hastigheten och omfattningen av fagocytisk aktivitet(figur 4).
Bild 1: En illustration som visar den centrala frågan om de presenterade uppgifterna, som är "Kan MSC återställa den fagocytiska aktiviteten hos IFN-γ behandlad MΦ?". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Översikt över arbetsflödet för samkultur och fagocytosanalys. En översikt över arbetsflödet för kvantitativ och kvalitativ analys av MΦ fagocytosis verksamhet i samkultur med MSC. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa kvantitativa data från de kinetiska avläsningsresultaten. I (A) är data representativa för ett experiment med optimal MΦ-celltäthet, i (B) data är representativa för ett experiment med suboptimala för låga MΦ-celltäthet, och i (C) är data representativa för ett experiment med suboptimal för hög MΦ-celltäthet. Den relativa fluorescensintensiteten mätt i relativa fluorescerande enheter (RFU) ritas på Y-axeln, medan tiden ritas på X-axeln. Observera skillnaderna i RFU-intervallet mellan optimala och suboptimala experiment. I A,MSC delvis rädda MΦ fagocytic aktivitet i inställningen av IFN-γ undertryckande under en 70 min period. RFU presenteras som medelvärde ± SEM, n = 6. Analysen utfördes med Tukeys multipla jämförelser efter en signifikant tvåvägs ANOVA, Interaktionseffekt P = 0,0001, Tidseffekt P = 0,0001 och Behandling/MSC-effekt P = 0,0001. Symboler anger resultat av flera jämförelsetester. * = signifikant skillnad mellan MSC/MΦ + IFN- γ vs MΦ + IFN-γ, Ŧ = signifikant skillnad mellan MΦ vs MΦ + IFN-γ och † = signifikant skillnad mellan MSC/MΦ vs MΦ. Se tabell 3 för detaljerade resultat av de flera jämförelsetesterna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Dynamiska bildvideor som ger visuell bekräftelse på den cellspecifika ökningen av fluorescens från sur aktivering av märkta zymosanpartiklar efter införlivandet i MΦ-phagolysosomen. Tidsfördröjningsinställningarna skapades var 1 minut under en 30-minuters period med en exponeringstid på 400 ms och EGFP-filteruppsättningen. A) MΦ i monokultur,B) MΦ i samkultur med MSC,c)MΦ behandlad med IFN-γ (250 ng/mL) och (D) MΦ behandlad med IFN-γ (250 ng/mL) i samkultur med MSC. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
Tabell 1: Exempel på en 96-väl plåtdesign. CBL - Cell tom; MSC - sådd dag 1; MΦ+ behandlad och MΦ obehandlad sådd dag 2; RBL reagens blankt tillsatt på analysdag 3.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
Tabell 2: Exempel på en 4-brunns kammarrutschbana. MSC - pläterad dag 1; MΦ+ behandlad och MΦ obehandlad pläterad dag 2.
| Tukeys test av flera jämförelser | Elak Diff. | 95.00% KI av diff. | Under tröskeln? | Sammanfattning | Justerat P-värde |
| 0 minuter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | -3871 | -9495 till 1754 | Nej | Ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ mot MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 till 6345 | Nej | Ns | 0.9873 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 till 5548 | Nej | Ns | >0.9999 |
| 10 minuter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | -3466 | -9091 till 2159 | Nej | Ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ mot MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 till 7950 | Nej | Ns | 0.7062 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 till 6617 | Nej | Ns | 0.968 |
| 20 minuter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | -1311 | -6936 till 4314 | Nej | Ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ mot MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 till 8940 | Nej | Ns | 0.422 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 till 8771 | Nej | Ns | 0.4689 |
| 30 minuter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 384.8 | -5240 till 6010 | Nej | Ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ mot MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 till 7937 | Nej | Ns | 0.7098 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 till 14350 | Ja | *** | 0.0005 |
| 40 minuter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 2247 | -3377 till 7872 | Nej | Ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ mot MΦ + IFN-γ | 4913 | -712,2 till 10537 | Nej | Ns | 0.1101 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 till 22145 | Ja | **** | <0.0001 |
| 50 minuter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 5657 | 32.12 till 11282 | Ja | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ mot MΦ + IFN-γ | 4932 | -692,9 till 10557 | Nej | Ns | 0.1079 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 till 24708 | Ja | **** | <0.0001 |
| 60 minuter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 12376 | 6752 till 18001 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ mot MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 till 14986 | Ja | *** | 0.0002 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 till 30373 | Ja | **** | <0.0001 |
| 70 minuter | |||||
| MSC/MΦ mot MΦ | 13770 | 8145 till 19395 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ mot MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 till 17612 | Ja | **** | <0.0001 |
| MΦ mot MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 till 32888 | Ja | **** | <0.0001 |
Tabell 3: Detaljerad statistisk analys av de uppgifter som presenteras i figur 3A. Resultat av Tukeys multipla jämförelsetester efter en betydande tvåvägs ANOVA av data som presenteras i figur 3A.
Kompletterande fil 1: En representativ kalkylbladsfil med rådata från ett optimalt experiment. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analys av fagocytos med hjälp av biopartiklar konjugerade till ett pH-känsligt färgämne är ett relativt nytt verktyg som har visat sig fördelaktigt jämfört med traditionella fluorescerande märkta partiklar12,19,20. Med traditionella fluorescerande märkta partiklar är endast slutpunktsanalys möjlig. Detektion utförs med fluorescerande mikroskopi och/eller spektrofluorometri efter tvätt eller släckning av partiklar som inte har tagits upp av fagocyten. Kvantitativa data som härrör från spektrofluorometri har potential att upptäcka icke-uppslukade partiklar, och bildanalys för att kvantifiera endast intracellulära partiklar är tråkigt och tidskrävande med hjälp av traditionella fluorescerande mikroskopisystem14. Biopartiklar som konjugeras till pH-känsliga färgämnen fluorescerar endast i en sur miljö som phagolysosomen, och därför är de tråkiga tvätt- och släckningsstegen onödiga14. Dessutom ger pH-känsliga märkta biopartiklar fördelen att tillhandahålla kinetiska data som inte lätt skulle förvärvas med FITC eller andra fluoroforkonjugerade biopartiklar.
Studier med detta nya verktyg har använt flödescytometri och/eller bildplattformar för att generera en kvantitativ och kinetisk mätning av fagocytaktivitet19,20,21. Flödescytometri är fördelaktigt om det finns en begränsad fagocytpopulation eller om man är intresserad av att sortera för nedströmsanalyser som genetiska skärmar19. MSC är kända för att reglera MΦ-fenotypen genom både direktkontakt och genom lösliga faktorer. Preliminära studier har visat att konditionerat medium från MSC undertryckte MΦ fagocytos, och därför utformades detta protokoll för att bestämma förändringarna i MΦ fagocytisk aktivitet medan i direkt samkultur med MSC. Under dessa förhållanden är spektrofluorometri för att kvantifiera och dynamisk avbildning för att visualisera och bekräfta fagocytisk aktivitet mest lämpliga.
Avgörande för framgången för dessa metoder är optimeringen av celltätheter. MSC måste pläteras med en densitet som möjliggör optimal cellkontakt med MΦ-cellerna. MΦ måste sås i mono- och samkulturer med en densitet som inte bara möjliggör optimal kontakt utan också möjliggör optimal fluorescensdetektering. För låg densitet resulterar i låg inkorporering i phagolysosom och små eller platta förändringar i relativa fluorescerande enheter(figur 3B). Om MΦ sås med för hög densitet ökar fagocytosen snabbt och detektion av skillnader mellan grupper maskeras (figur 3C). Att optimera koncentrationen av pH-känsligt färgämne märkt zymosanpartiklar per cellnummer är också avgörande. Preliminära experiment bör utföras för att optimera celltätheten hos MSC och MΦ, och antalet partiklar per MΦ-cell. Dessutom bör dessa optimeringssteg vidtas om andra märkta biopartiklar används, till exempel E. coli eller S. aureus.
Lämpligt bildmedium är också kritiskt. Mediet för båda metoderna bör vara ett buffrat medium och bör inte innehålla fenolrött. Fenolrött dämpar detektion av fluorescerande utsläpp. Dessutom kommer alla tillsatser eller tillstånd som kan försura mediet att aktivera de märkta partiklarna i förtid och införa förhöjd bakgrund. Reagensämnet är avgörande för att identifiera den potentiella försurningen av mediet.
Dessa protokoll kan inte bara användas för att undersöka MSC-reglering av MΦ fagocytos av en mängd olika pH-känsliga biopartiklar, utan metoden kan också tillämpas på en mängd olika samkulturmodeller som inkluderar neutrofiler och andra fagocyter. Dessutom, genom att använda denna modell, molekyler och vägar misstänks vara inblandade i cell kontaktmedierad reglering av makrofag phagocytic aktivitet kan undersökas via siRNA eller CRISPR medierad down-regulation för att validera eller motbevisa misstänkta molekylära mål. Potentiella mål inkluderar vidhäftningsmolekyler, fagocytiska receptorer och integrinmolekyler.
Arbetet med dessa metoder kommer att avslöja ny information om signalmekanismerna bakom de ökade fagocytiska svaren av MΦ efter cellkontaktinteraktioner med MSC, vilket främjar vår förståelse av den roll MSC spelar för att reglera medfödd immunitet. Studier som dessa behandlar ett understudiet område och kommer att ge en fullständig bild av msc:s inflytande på makrofagaktiviteten, vilket är nödvändigt för en fullständig förståelse av deras roll i immuniteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF:s mekanism för större forskningsinstrument under bidragsnummer 1626093 och 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D.
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
