Summary
Bu protokol, GST ile kaynaşmış TPR motifli yardımcı refakatçiler ve Hsp90 türevli peptit ile birleştirilmiş alıcı boncuklar ile glutatyon bağlantılı donör boncuklar kullanarak protein-protein etkileşimlerini yoklama tekniği sunar. Bu tekniği, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.
Abstract
Isı şok proteini 90 (Hsp90)-cochaperone etkileşimlerinin hedeflenerek Hsp90'a bağımlı hücre içi süreçleri özel olarak düzenleme imkanı sağlar. Hsp90'ın C-terminusundaki korunmuş MEEVD pentapeptid, eş refakatçilerin tetratrikopeptid tekrarı (TPR) motifi ile etkileşimden sorumludur. FK506 bağlayıcı protein (FKBP) 51 ve FKBP52, farklı işlevlere sahip steroid hormona bağımlı hastalıklarda yer alan iki benzer TPR motifli yardımcı refakatçidir. Bu nedenle, özellikle Hsp90 ve FKBP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimleri engelleyen moleküllerin tanımlanması, birkaç insan hastalığı için umut verici bir terapötik potansiyel sağlar. Burada, Hsp90 ve ortağı ortak refakatçiler FKBP51 ve FKBP52 arasındaki etkileşimleri araştırmak için güçlendirilmiş bir lüminesans yakınlık homojen test protokolünü açıklıyoruz. İlk olarak, TPR motif içeren proteinler FKBP51 ve FKBP52'yi glutatyon S-transferaz (GST) etiketli formda saflaştırdık. GST ile kaynaşmış TPR motifli proteinler ile glutatyon bağlantılı donör boncukları ve Hsp90'ın 10 mer C-terminal peptidi ile birleştirilmiş alıcı boncukları kullanarak, homojen bir ortamda protein-protein etkileşimlerini araştırdık. Bu testi, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.
Introduction
Moleküler refakatçiler protein katlanması, taşınması ve bozulması da dahil olmak üzere protein homeostazlarına katkıda bulunur. Birkaç hücresel süreci düzenlerler ve kanser ve nörodejeneratif hastalıklar gibi çok sayıda hastalıkla bağlantılıdırlar1. Isı şoku proteini 90 (Hsp90), işlevi ATP hidrolizi tarafından yönlendirilen konformasyonel değişikliklere ve yardımcı refakatçilerinin aracılık ettiği müşteri proteinleri ile bağlanmasına bağlı olan en önemli refakatçilerden biridir2. Hsp90'ın terapötik hedef olarak bariz bir potansiyeline rağmen, işlevinin ince ayarını büyük bir zorluk temsil eder. Klinik çalışmalarda değerlendirilen N-terminal ATP bağlama bölgesini hedefleyen birkaç Hsp90 inhibitörü vardır, ancak hiçbiri pazarlama için onaylanmamıştır3. İyi tanımlanmış bir ligand bağlayıcı cep olmaması nedeniyle4, Hsp90'ın C terminali bölgesini hedeflemek sınırlı başarıya sahipti4. Son zamanlarda, Hsp90-cochaperone etkileşimlerinin küçük moleküller tarafından bozulması alternatif bir strateji olarak araştırılmıştır5. Hsp90-cochaperone etkileşimlerinin hedeflmesi genel hücre stres tepkisi oluşturmaz ve çeşitli hücre içi süreçleri özel olarak düzenleme olanağı sağlar. Hsp90'ın C-terminus'ında korunan MEEVD pentapeptid, eş refakatçilerin tetratrikopeptid tekrarı (TPR) motifi6ile etkileşimden sorumludur. İnsan protein veritabanında açıklamalı 736 TPR motif içeren proteinden~ 20 farklı protein bu peptit aracılığıyla Hsp90 ile etkileşime girer7. MEEVD peptit bağlama için yarışan moleküller, Hsp90 ve TPR alanı içeren yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşimleri bozayar. Peptit bağlama bölgesi benzer üçüncül yapıya sahiptir, ancak farklı TPR motif alanları arasındaki genel homoloji nispeten düşüktür7Özellikle Hsp90 ve belirli TPR motifli yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşimleri engelleyebilen molekülleri tanımlamak için bir fırsat sağlar. Bu TPR motifli yardımcı refakatçiler arasında, FK506 bağlayıcı protein (FKBP) 51 ve FKBP52 steroid hormon reseptör (SHR) sinyal düzenleyicileri ve kanser, strese bağlı hastalıklar, metabolik hastalıklar ve Alzheimer hastalığı dahil olmak üzere çeşitli steroid hormon bağımlı hastalıklara dahil8vardır. FKBP51 ve FKBP52% 80 sıra benzerliğini > paylaşsa da, işlevleri farklıdır: FKBP52 SHR aktivitesinin pozitif bir düzenleyicisidir, FKBP51 ise çoğu durumda negatif bir düzenleyicidir8. Bu nedenle, moleküllerin tanımlanması, özellikle Hsp90 ve FKBP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimleri bloke etmek, ilgili hastalıklar için umut verici bir terapötik potansiyel sağlar.
Mplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) ilk olarak 1994 yılında Ullman EF ve ark.9tarafından geliştirilmiştir. Şimdi peptit 10 , protein11, DNA 12 , RNA13ve şeker14gibi farklı biyolojik etkileşim türlerini tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknikte iki çeşit boncuk (çap 200 nm), biri donör boncuk, diğeri kabul eden boncuk vardır. Biyomoleküller bu boncukların üzerine hareketsiz hale getirilir; biyolojik etkileşimleri donör ve alıcı boncukları yakınlığa getirir. 680 nm'de, donör boncuktaki bir ışığa duyarlılıklayıcı oksijeni aydınlatır ve tek oksijene dönüştürür. Tek oksijenin ömrü kısa olduğu için sadece 200 nm'ye kadar yayılabilir. Kabul eden boncuk yakınsa, tiyoksen türevi 370 nm'de tek oksijen üreten chemiluminescence ile reaksiyona gelir. Bu enerji, 520-620 nm15'teışık yaymak için aynı kabul edici boncuktaki floroforları daha da aktive eder. Biyolojik etkileşimler bozulursa, alıcı boncuk ve donör boncuk yakınlığa ulaşamaz, bu da tek oksijen çürümesine ve düşük üretilen sinyale neden olur.
Burada, başta FKBP51 ve FKBP52 olmak üzere Hsp90 ve TPR yardımcı refakatçileri arasındaki etkileşimleri engelleyen küçük molekülleri taramak için bu tekniği kullanan bir protokol açıklıyoruz. Hsp90 aşırı C-terminusuna karşılık gelen 10 amino asit uzunluğunda peptit, kabul eden boncuklara bağlanır. Saflaştırılmış GST etiketli TPR yardımcı refakatçileri glutatyon bağlantılı donör boncuklarla etkileşime girer. Hsp90 türevi peptitler ve TPR motifli yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşim boncukları bir araya getirdiğinde, güçlendirilmiş bir sinyal üretilir (Şekil 1A). Taranmış küçük moleküller Hsp90 ve TPR motifli yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşimleri engelleyebilirse, bu güçlendirilmiş sinyal azaltılacaktır (Şekil 1B). IC50'leri nicel ölçümle hesaplanabilir. Bu protokol herhangi bir refakatçiye genişletilebilir - TPR motifli ortak refakatçi etkileşimleri ilgi çekicidir ve özellikle Hsp90 ve FKBP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimi engelleyen yeni moleküllerin geliştirilmesinde büyük önem taşır.
Şekil 1: Bu tahlilin temel prensibi. (A) Saflaştırılmış GST-FKBP51 glutatyon bağlantılı donör boncuklarla etkileşime girer. Hsp90'ın aşırı C-terminusuna karşılık gelen 10 amino asit uzunluğundaki peptitler kabul eden boncuklara bağlanır. Hsp90 türevi peptitler ile FKBP51'in TPR etki alanı arasındaki etkileşim, donör ve alıcı boncukları yakınlığa getirir. 680 nm'de, donör boncuktaki bir ışığa duyarlılıklayıcı oksijeni aydınlatır ve tek oksijene dönüştürür. Kabul eden boncuk üzerindeki tiyoksin türevi singlet oksijen ile reaksiyona sokur ve 370 nm'de chemiluminescence üretir. Bu enerji, 520-620 nm'de ışık yaymak için aynı kabul edici boncuktaki floroforları daha da aktive eder. (B) Küçük moleküller Hsp90 ve FKBP51 arasındaki etkileşimleri engellediğinde, donör ve alıcı boncuklar yakınlığa ulaşamaz. Daha sonra kısa ömürlü tek oksijen bozunur ve tespit edilebilir bir sinyal üretilmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokole genel bir bakış Şekil 2'de gösterilmiştir.
1. GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'nin ekspresyy edilmesi ve saflaştırılması (Şekil 2A)
-
Plazmid
NOT: IMAGE konsorsiyumundan insan FKBP51 (klonlama kimliği: 5723416) ve insan FKBP52 (klon kimliği: 7474554) için cDNA klonları edinin.- BamHI ve XhoI çıkıntılarını içeren pcr ile pcr tarafından insan FKBP51 DNA'sını güçlendirin (ileri; 5'GGATCCATACTACTGATGAAGGT-3', ters; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') BamHI ve XhoI çıkıntılarını içerir ve BamHI / XhoI kısıtlama bölgelerinde pGEX6-1 vektörüne klonlar.
- EcoRI ve XhoI çıkıntılarını içeren pcr ile pcr tarafından insan FKBP52 DNA'sını güçlendirin (ileri; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', ters; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') EcoRI ve XhoI çıkıntılarını içerir ve EcoRI / XhoI kısıtlama sahalarında pGEX6-2 vektörüne klonlayın.
NOT: PCR reaksiyon kurulumu ve koşulları Tablo 1 ve Tablo 2'degösterilmiştir. - Eklenen sırayı doğrulayın ve plazmidleri üretim protokolüne göre kimyasal olarak yetkin E. coli'ye dönüştürün.
-
Protein ekspresyyürü ve saflaştırma
- LB çözeltisini yapmak için 1 L damıtılmış suya 25 g Luria suyu (LB) tabanı ekleyin. 15 dakika boyunca 121 °C'de otoklavlav. Soğudktan sonra 50 μg/mL ampisilin ekleyin.
- GST-FKBP51 veya GST-FKBP52'yi ifade eden bir bakteri kolonisi alın ve 1,5 mL'lik bir tüpte 500 μL LB çözeltisi ile karıştırın. Girdap.
- Alüminyum folyo ile kaplanmış Erlenmeyer şişesinde 1 L LB çözeltisine "1.2.2" karışımını ekleyin. Erlenmeyer şişesini 37 °C'de bir gecede çalkalayıcıya inküb kuluçkaya yatırın.
- Erlenmeyer şişesine 1 mM izopropil-β-D-tiyogalactoside (IPTG) ekleyerek protein ekspresyonunu teşvik edin ve kuluçkaya 2 saat daha devam edin.
- Hücre peletleri almak için, 15 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüj. Üsttekini çıkarın.
NOT: Hücre peletleri -20 °C'de saklanabilir. - Hücre peletlerini 40 mL PBS'de yeniden dirildi ve buz üzerinde 3 x 20 sn sonicate. Proteolizi önlemek için 1 mM PMSF, 1 mM EDTA ve proteaz inhibitörü kokteyli (1 tablet) ekleyin.
- Hücre kalıntılarını gidermek ve süpernatantı 5 mL GST tuzak sütununa uygulamak için süspansiyonu 30 dk 50.000 x g santrifüj edin.
- Sütunu 30 mL PBS ile yıkadıktan sonra, PBS'de 5 mL 10 mM glutatyon ile GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'yi elüte edin.
- Proteinleri 15 mL 10.000 MWCO santrifüj ünitesine yoğunlaştır. Serbest glutatyonu çıkarmak için, konsantreleri 0,5x PBS ile dengelenmiş PD-10 kolonlarından geçirin ve tekrar filtre santrifüj cihazına konsantre olun.
- Protein içeren fraksiyonları toplayın. SDS-PAGE'deki proteinleri doğrulayın ve protein konsantrasyonlarını 1 mg/mL'ye ayarlayın.
NOT: Tipik protein verimi 2-5 mg/L kültürüdür. Protein -20 °C'de saklanabilir.
2. Hsp90 C-terminal peptidinin kabul eden boncuklara bağlanması (Şekil 2B)
-
Hsp90 peptit hazırlama
- Bir peptit sentez servisi tarafından insanHsp90 beta izoformunun (UniProt ID: P08238) amino asitleri 714-724'e karşılık gelen on amino asit peptit NH 2 -EDASRMEEVD-COOH sentezleyin.
- Hsp90 peptidi PBS'de 1 mg/mL konsantrasyonda seyreltin.
-
Kabul eden boncuk hazırlama
- Yargısız kabul eden boncukları PBS'de 1 mg/mL konsantrasyona seyreltin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Yıkamayı 15 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleme ile gerçekleştirin. Üst saltanayı dikkatlice çıkarın.
-
Konjugasyon
- Boncuk ve peptit arasındaki oranı 10:1 olarak ayarlayın. 1 mg kabul edici boncuk pelet içeren 1,5 mL tüpte (yukarıda açıklandığı gibi), 1 mL PBS (pH 7.4), 0.1 mg seyreltilmiş peptit ekleyin, 1.25 μL ara-20, 10 μL 400 mM sodyum sitanoborohidrit çözeltisi (NaBH3CN) suda.
DİkKAT: NaBH3CN toksiktir; duman kapüşonu ve eldiven kullanın. NaBH3CN çözeltisi taze hazırlanmalıdır. - Döner çalkalayıcı üzerinde uç-uç ajitasyon (10-20 rpm) ile 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yaslanın.
- Boncuk ve peptit arasındaki oranı 10:1 olarak ayarlayın. 1 mg kabul edici boncuk pelet içeren 1,5 mL tüpte (yukarıda açıklandığı gibi), 1 mL PBS (pH 7.4), 0.1 mg seyreltilmiş peptit ekleyin, 1.25 μL ara-20, 10 μL 400 mM sodyum sitanoborohidrit çözeltisi (NaBH3CN) suda.
-
Reaksiyon söndürme ve boncuk yıkama
- Tepkisiz siteleri engellemek için reaksiyona 20 μL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
- 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'da (veya maksimum hızda) santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve boncuk peletini 1 mL Tris-HCl çözeltisinde (100 mM, pH 8.0) yeniden kullanın.
- Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
- Son santrifüjlemeden sonra, boncukları depolama tamponunda 1 mg/mL'de yeniden depolar (1 mL 0,5 × koruyucu olarak% 0,01 sodyum azit ile PBS). Konjuge kabul eden boncuk çözeltisini 4 °C ışık korumalı olarak saklayın.
DİkKAT: Sodyum azit toksiktir; duman kapüşonu ve eldiven kullanın.
3. GST-FKBP51 veya GST-FKBP52 ve Hsp90 C-terminal peptit arasındaki etkileşimi ve küçük moleküler kütle bileşikleri ile inhibisyonu araştıran tahlil (Şekil 2C)
-
Glutatyon donör boncuklarla etkileşime giren GST etiketli proteinler
- Reaksiyonları 384 kuyu plakasına kurun.
- Glutatyon donör boncuklarının 10 μg/mL'lik çözeltisini 0,5x PBS, pH 7,4'te hazırlayın.
NOT: Uzun süreli depolamadan sonra boncuklar yerleşir ve girdaplı olması gerekir. - 10 μg/mL'lik son konsantrasyona GST-FKBP51 veya GST-FKBP52 ekleyin.
- 10 dakika boyunca 25 °C'de karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
NOT: Bu adımda, GST etiketli proteinler boncuklara bağlı glutatyon ile etkileşime girecektir. Her kuyu için, bu karışımın 22,5 μL'si kullanılacaktır. Bağlayıcı ortakların konsantrasyonu ampirik olarak belirlenmelidir. Titrate GST-FKBP51 ve GST-FKBP52 ve en iyi sinyali veren konsantrasyonu seçin.
-
Bileşik ekleme
- DMSO'daki test bileşiklerinin seri seyreltmelerini yapın.
NOT: Kullanılan konsantrasyonlar tipik olarak 10, 30, 100, 300, 1.000 ve 3.000 μM'dir. - Plakanın her kuyusunun köşesine 0,25 μL DMSO (negatif kontrol) veya Hsp90 C-terminal peptit (pozitif kontrol, 30 μM) veya DMSO bileşikleri ekleyin. Her bileşik konsantrasyon için triplicates kullanın.
- Her kuyuya GST etiketli proteinli glutatyon donör boncukları içeren çözeltinin 22,5 μL'sini ekleyin.
- Tabağı elinizle hafifçe ama iyice sallayın. 15 dakika boyunca 25 °C'de karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
NOT: Bu süre zarfında bileşikler Hsp90 C-terminal peptit bağlama sitesindeki TPR etki alanıyla etkileşime girecektir.
- DMSO'daki test bileşiklerinin seri seyreltmelerini yapın.
-
Kabul eden boncuk ekleme
- Kabul eden boncukları ekli Hsp90 C-terminal peptit ile 0,5x PBS'de 100 μg/mL'ye seyreltin.
- Her kuyuya 2,25 μL seyreltilmiş kabul edici boncuk ekleyin.
- Hafifçe ama iyice karıştırın. 15 dakika boyunca 25 °C'de karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
NOT: Bu adımda, donör ve kabul eden boncuklar protein-peptit etkileşimleri ile yakınlığa getirilir. Reaksiyon karışımının son hacmi 25 μL'dir. Bu nedenle, bileşiklerin son konsantrasyonları 0,1 ila 30 μM arasında değişiyor.
-
Plaka okuma
NOT: İlgili modda ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.- Cihazı açın ve yazılımı açın
- İlgili protokolü seçin.
- Plaka haritasını düzenle'yi tıklatın ve ölçüm için plakada kullanılan kuyuyu seçin.
- Devam etmek ve Seçili iletişim kuralını çalıştırmak için İleri'yi tıklatın.
- Ölçümden sonra sonuçları görüntülemek için Sonuçları Göster'i tıklatın.
- Verileri verin.
4. Veri analizi
-
Z' faktörü ve sinyal-arka plan (S/B) oranı
- Aşağıdaki denklemi kullanarak test için Z' faktörünü ve S/B oranını hesaplayın:
Z'=1-(3φpos+3φneg)/│μpos-μneg│16
S/B=μneg/μpos
burada, σ ve μ sırasıyla pozitif (Hsp90 C-terminal peptit, 30 μM) ve negatif (DMSO) kontrollerinin standart sapmalarını ve araçlarını temsil eder. 0,5 > bir Z faktörü, testlerin tarama için yeterince sağlam olmasını sağlayacaktır. Test hassasiyetini izlemek için S/B oranı da hesaplanmıştır.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak test için Z' faktörünü ve S/B oranını hesaplayın:
-
Doz yanıt eğrisi ve IC 50
NOT: Hsp90-cochaperones PPI inhibitörlerinin verilerine yazılım tarafından uyacak şekilde doğrusal olmayan regresyon analizi kullanın.- Hoş Geldiniz iletişim kutusunda bir XY veri tablosu oluşturun ve X Numaraları'nı seçin ve Y Enter 3 (üç taraflıysa) yan yana sütunlardaki değerleri çoğaltın.
- Numunelerin sinyal verilerini negatif kontrol grubuna normalleştirin. Konsantrasyon değerlerini X sütununa ve sinyal değerlerini Y sütununa içe aktarın.
- Çözümle'yi tıklatın ve Dönüştür | altında Dönüştürme konsantrasyonu (X) öğesini seçin Normalleştirin. Logaritmaya Dönüştür 'üseçin.
NOT: Bu, konsantrasyonu bir günlük ölçeğine dönüştürür. Başlangıç konsantrasyonunuz sıfırsa, sıfır logaritması tanımlanmadığından bu değerleri kaybetmemek için etkili bir şekilde sıfır (örneğin, 0,1 nM) olan çok küçük bir sayıya ayarlayın. - Analiz Et'i tıklatın ve XY analizlerialtında Doğrusal olmayan regresyon (eğri sığdırma) seçeneğini belirleyin, Doz-Yanıt İnhibisyonunu açın ve Log(inhibitör) ile yanıt -- Değişken eğim 'iseçin.
- Sonuçları (IC50 değerini içeren) ve Grafiklerigörüntülemek için Tamam 'ı tıklatın.
Şekil 2: Bu protokolün şeması. (A) GST-FKBP51 ve GST-FKBP52'nin ifade edilmesi ve saflaştırılması. (B) Hsp90 C-terminal peptidinin kabul eden boncuklara bağlanması. (C) GST-FKBP51 veya GST-FKBP52 ve Hsp90 C-terminal peptit arasındaki etkileşimi araştıran test. Küçük moleküler kütle bileşikleri ile inhibisyon. BioRender.com ile oluşturuldu Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tahlillerimizde, Z faktörü ve S/B oranı sırasıyla 0,82 ve 13,35'tir (Şekil 3A), testimizin yüksek verimli tarama için sağlam ve güvenilir olduğunu gösterir. Daha sonra küçük moleküler kütle bileşiklerini taramak için kullandık. Şekil 3B, seçilen küçük bir molekülle (D10) refakatçi-cochaperone etkileşimlerinin doza bağlı inhibisyonunu sunar. D10 için doz yanıt eğrileri,IC 50 değerlerinin hesaplanmasına bağlı olarak doğrusal olmayan regresyon analizi tarafından oluşturulur. D10 hem Hsp90 - GST-FKBP51 hem de Hsp90 - GST-FKBP52 PPI'larda doza bağlı inhibisyon gösterir. Ancak IC50'nin değerleri farklıdır: Hsp90 içinIC 50 - GST-FKBP51 etkileşimleri 65 nM'dir, Hsp90 - GST-FKBP52 etkileşimleri için ise en yüksek bileşik konsantrasyonla (100 μM) tam inhibisyon sağlanmamıştır, IC50'nin 30 μM > olduğu tahmin edilmektedir. Bu sonuçlar, Hsp90-HKBP51 veya Hsp90-FKBP52 PPI'lerin küçük moleküllerle seçici inhibisyonunun elde edilebildiğine dair kanıt sağlar (FKBP51 ve FKBP52'nin TPR etki alanları% 60 sıralı kimliğe ve % 80 sıra benzerliğine >) ve bu test bu tarama için uygulanabilir.
Şekil 3: Tahlil analizi ve sonuçları. (A) Z' faktörü ve bu tahlilin sinyal-arka plan (S/B) oranı. Veriler, 48 kuyudan gelen (¹) pozitif kontrol (Hsp90 C-terminal peptit, 30 μM) ve (●) negatif kontrol (DMSO) sinyallerini temsil eder. Bu iki veri popülasyonundan 0,82 Z' değeri ve 13,35 S/B oranı hesaplanmıştır. (B) Bu testte seçilen bileşiğin (D10) FKBP51 (●) veya FKBP52 (¹) ile olan etkileşimleri üzerinde inhibisyonu. D10, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 dozunu bağımlı olarak inhibe eder. IC50, Hsp90-FKBP51 etkileşimi için 65 nM'dir, ancak Hsp90-FKBP52 etkileşimi için 30 μM'nin üzerindedir. Veriler kontrol grubuna normalleştirilir ve SEM ± araçlar olarak ifade edilir.
| Reaksiyon bileşeni | Hacim (μL) |
| PCR tamponu (5 x konsantre) | 4 |
| İleri astar | 1 |
| Ters astar | 1 |
| Plasmid | 0.5 |
| dNTP karışımı (her biri 10 mM) | 0.5 |
| Phusion DNA polimeraz | 0.5 |
| Su (DNA sınıfı) | 12.5 |
| Toplam | 20 |
Tablo 1: pcr reaksiyonu insan FKBP51 ve FKBP52 DNA amplifikasyonu için kuruldu.
| Safha | Sıcaklık (°C) | Saat | Döngü |
| İlk denatürasyon | 94 | 3 dk | 1 |
| Denatürasyon | 94 | 30 sn | 35 |
| Tavlama | 56 | 30 sn | |
| Uzantı | 72 | 1 dk | |
| Son uzantı | 72 | 5 dk | 1 |
| Not: Kapak sıcaklığı 105 °C'dir. |
Tablo 2: İnsan FKBP51 ve FKBP52 DNA amplifikasyonu için termosyeler koşullar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, başta FKBP51 ve FKBP52 olmak üzere Hsp90 ve TPR motifli yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşimleri engelleyen küçük molekülleri taramak için test kullanan bir protokol açıklıyoruz. Yüksek Z' puanı (>0,8), yüksek aktarım hızı formatının sağlamlığını ve güvenilirliğini gösterir. Sonuçlar bir saat içinde elde edilebilir ve az miktarda boncuk, protein ve bileşik gereklidir. Ayrıca, bu protokol herhangi bir Hsp90/Hsp70 - TPR motifli co-chaperone etkileşimlerine kolayca genişletilebilir. Hsp90'ın çeşitli TPR motifli yardımcı refakatçileri Alzheimer hastalığından otoimmün hastalıklara, kansere vb. Burada açıklanan protokol, yüksek tıbbi öneme sahip refakatçi-cochaperone etkileşimlerini engelleyen küçük moleküllerin yüksek verimli taraması için in vitro sağlam ve ucuz bir test sağlar.
Buna ek olarak, TPR alanlarını hedefleyen ve Hsp90 ile etkileşimi engelleyen ilaçlar sadece hedefe olan yakınlıkları için değil, aynı zamanda diğer TPR motifli proteinlere karşı seçicilikleri için de değerlendirilmelidir. İnsan genom, Hsp90 C-terminal peptit ile etkileşime girebilen > 20 TPR motif proteinini kodlar. Glutatyon boncukları ve GST etiketli proteinler kullanılarak yapılan bu tahlil, ilaç etkisinin birden fazla bağlayıcı TPR ortağı üzerinde değerlendirilmesini sağlar. Laboratuvarımız GST etiketli formlarında 20 insan TPR proteini kütüphanesine sahiptir ve test edilen her küçük molekül için benzeşim ve seçicilik profilleri elde edebilir.
Daha önce Hsp90 ve TPR yardımcı refakatçileri arasındaki ÜFE'nin Hsp90'ın C-terminal peptidi ile aracılık ettiği gösterilmiştir; Hsp90 C-terminus'un silinmesi, TPR motifli yardımcı refakatçilerin6. Hsp90 C-terminal peptidinin kullanıldığı testlerimizde verimli bileşiklerin, glutatyon sepharose boncukları (veriler gösterilmez) kullanılarak yapılan bir çekme testinde tam uzunluktaki Hsp90'ın GST-FKBP51/52 ile etkileşimini engelleyebildiğini bulduk. Seçilen bileşiklerden bazıları ayrıca yüzey plazmon rezonans teknolojisi ile FKBP51 ile bağlayıcı yakınlık göstermektedir ve ortak kristalizasyon ile belirlenen spesifik bağlama bölgeleri şu anda incelenmektedir.
Protokolümüzdeki kritik bir adım ekleme sırasıdır; önce küçük bir molekül ile TPR hedefi arasında bir kompleks oluştururuz. FKBP51 ve Hsp90 C-terminal peptit arasındaki kompleksler zaten oluşmuşsa, PPI'ları kırmak için daha uzun kuluçka süreleri ve daha yüksek ilaç bileşik konsantrasyonları gerekir. Bu çoğunlukla, moleküllerin etkileşim bölgesine erişimini sınırlayan boncukların sterik engelinden kaynaklanmaktadır.
TPR proteinlerini ve Hsp90 C-terminal peptitlerini sırasıyla donör ve alıcı boncuklara çiftleştirmek ve doğrudan PPI'ları araştırmak mümkündür. Bununla birlikte, etkileşimlerin kinetiğini etkileyen çözeltideki moleküllerin hareketinin azalması nedeniyle her iki bağlayıcı ortağın da boncuklara kovalent olarak bağlanması önerilmez. Bu aynı zamanda boncuk boyutu nedeniyle sterik engel riskini de arttırır. Bu nedenle, birden fazla TPR ortağının değerlendirilebileceği tahlillerimizde GST etiketli proteinlerle etkileşime giren Hsp90 C-terminal peptit ve glutatyon donör boncuklarla birleştirilmiş alıcı boncukları seçiyoruz.
Bu testte, tespit edilen bazı bileşiklerin, singlet oksijeni söndürme, ışığı söndürme ve ışığı dağıtma gibi test teknolojisine müdahaleleri nedeniyle yanlış pozitif olabileceği muhtemeldir. Yanlış-pozitif sonuçlar, GST etiketinin glutatyon donör boncuklarla bağlanmasını bozarak da indüklenebilir. Seçici inhibitörleri tanımlamak için hem Hsp90-FKBP51 hem de Hsp90-FKBP52 PPI'lerdeki molekülleri tadırken bu yanlış-pozitif sonuçlar önlenebilir. Seçilen inhibitörleri doğrulamak için PPI'ları algılayan diğer yöntemler de uygulanmalıdır.
Testimizin sınırlaması, hücre lysates gibi ham biyolojik örneklerde Hsp90 ve TPR motifli yardımcı refakatçiler arasındaki etkileşimi tespit etmek için kullanılamamasıdır. Yüksek verimli taramadan sonra, biyolojik örneklerde Hsp90 - TPR motifli co-chaperones PPI üzerindeki seçili bileşiklerin inhibisyonlarının, eş-immün özürlülük ve yakınlık ligasyon tahlilleri gibi diğer yöntemlerle doğrulanması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını bildiriyor.
Acknowledgments
Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi (2018-02843), Beyin Vakfı (Fo 2019-0140), Karolinska Institutet Geriatrik Hastalıklar Vakfı, Gunvor ve Josef Anérs Vakfı, Magnus Bergvalls Vakfı, Gun ve Bertil Stohnes Vakfı, Tıbbi Araştırmalar için Tore Nilssons Vakfı, Margaretha af Ugglas vakfı ve Eski Hizmetliler Vakfı'nın hibeleriyle desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
References
- Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
- Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
- Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
- Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
- Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
- Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
- Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
- Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
- Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
- Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
- Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
- Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
- Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
- Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
- Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
