होस्ट कोशिकाओं के लिए बैक्टीरियल पालन का स्वचालित, उच्च थ्रूपुट डिटेक्शन
Summary
स्वचालित सांख्यिकीय विश्लेषण विधियों के साथ-साथ उच्च-थ्रूपुट फ्लोरेसेंस लेबलिंग इमेजिंग का उपयोग करके फेनोटाइपिक पालन के आधार पर मेजबान-बैक्टीरियल रोगजनक इंटरैक्शन का पता लगाना मेजबान कोशिकाओं के साथ संभावित बैक्टीरियल इंटरैक्शन का तेजी से मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है।
Abstract
उभरते जीवाणु रोगजनकों की पहचान मानव स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए महत्वपूर्ण है । मेजबान कोशिकाओं के लिए जीवाणु पालन जीवाणु संक्रमण में एक आवश्यक कदम है और संभावित खतरे की एक बानगी का गठन किया । इसलिए, कोशिकाओं की मेजबानी के लिए बैक्टीरिया के पालन की जांच बैक्टीरिया खतरे के आकलन के एक घटक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । मेजबान कोशिकाओं के लिए जीवाणु पालन की गणना के लिए एक मानक विधि मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया को सह-इनक्यूबेट करना, अनुयायी बैक्टीरिया को फसल करना, ठोस मीडिया पर काटा गया कोशिकाओं को प्लेट करना, और फिर परिणामी कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीआईएफयू) को गिनना है। वैकल्पिक रूप से, मेजबान कोशिकाओं के जीवाणु पालन का मूल्यांकन इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके किया जा सकता है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों को लागू करने के लिए पारंपरिक रणनीतियां समय लेने वाली और अक्षम हैं । यहां, हाल ही में विकसित स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित इमेजिंग विधि का वर्णन किया गया है। जब उच्च थ्रूपुट छवि प्रसंस्करण और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ संयुक्त किया जाता है, तो विधि मेजबान कोशिकाओं का पालन करने वाले बैक्टीरिया के तेजी से मात्राकरण को सक्षम बनाती है। प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए दो जीवाणु प्रजातियों, ग्राम-नकारात्मक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और ग्राम-सकारात्मक लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन और इसी नकारात्मक नियंत्रण का परीक्षण किया गया । परिणाम बताते हैं कि यह दृष्टिकोण तेजी से और सही रूप से अनुयायी बैक्टीरिया की गणना करता है और प्रयोगात्मक वर्कलोड और समयसीमा को काफी कम कर देता है।
Introduction
बैक्टीरियल आसंजन एक प्रक्रिया है जिससे बैक्टीरिया अन्य कोशिकाओं या सतहों से जुड़ते हैं। जीवाणु रोगजनकों द्वारा संक्रमण की सफल स्थापना के लिए कोशिकाओं की मेजबानी करने, ऊतकों के उपनिवेशीकरण और कुछ मामलों में, मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण1,2,3की आवश्यकता होती है। उभरते संक्रामक रोग प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरों का गठन करते हैं, जैसा कि हाल ही में COVID-19 महामारी4,5,6से सबूत है। महत्वपूर्ण बात यह है कि जीनोमिक-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके नए या उभरते रोगजनकों को आसानी से नहीं समझा जा सकता है, विशेष रूप से उन मामलों में जहां रोगजनक को पता लगाने से बचने के लिए इंजीनियर किया गया है या इसमें जीनोमिक हस्ताक्षर नहीं होते हैं जो इसे रोगजनक के रूप में पहचानते हैं। इसलिए, संभावित रोगजनकों की पहचान उन तरीकों का उपयोग करके जो सीधे रोगजनकता की पहचान का आकलन करते हैं, जैसे मेजबान कोशिकाओं के बैक्टीरियल पालन, रोगजनक पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।
1,7दशकों तक जीवाणु रोगजनकता के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए मेजबान कोशिकाओं का जीवाणु पालन कियाजाता रहाहै . माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग8,9 और बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने वाली इकाई(सीएफयू) 10, 11,12,13 की गणना पोस्ट-इंफेक्शन प्लेटिंग द्वारा माइक्रोबियल पालन और/या मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण के परीक्षण के लिए दो अच्छी तरह से विकसित प्रयोगशाला विधियां हैं14। बैक्टीरियल कोशिकाओं के माइक्रोमीटर पैमाने के आकार को ध्यान में रखते हुए, अनुयायी बैक्टीरियल कोशिकाओं की गणना के लिए आम तौर पर उन्नत उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है, साथ ही इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, विस्तार माइक्रोस्कोपी (ExM)15,16,और त्रि-आयामी इमेजिंग17 सहित उच्च-संकल्प इमेजिंग दृष्टिकोण . वैकल्पिक रूप से, मेजबान कोशिकाओं के भीतर बंधे या आंतरिक बैक्टीरिया की गणना ठोस आगार पर काटे गए बैक्टीरिया की कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला को चढ़ाना और परिणामीसीएफयू 10 , 12,13की गणना करके किया जा सकता है। यह विधि श्रमसाध्य है और इसमें कई मैनुअल चरण शामिल हैं, जो उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण18, 19के लिए आवश्यक मानकीकृत या स्वचालित प्रक्रियास्थापितकरने में कठिनाइयों का परिचय देते हैं। इसलिए, मेजबान सेल लगाव के मूल्यांकन के लिए नए तरीकों के विकास क्षेत्र में वर्तमान सीमाओं को संबोधित करेंगे ।
ऐसी ही एक विधि यहां वर्णित है जो स्वचालित उच्च थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करती है, जो उच्च थ्रूपुट छवि प्रसंस्करण और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ संयुक्त है। दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए, कई जीवाणु रोगजनकों के साथ प्रयोग किए गए थे, जिनमें स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,मनुष्यों, जानवरों और पौधों के एक अवसरवादी ग्राम-नकारात्मक जीवाणु रोगजनक14,20शामिल थे, जो अक्सर बिगड़ा मेजबान रक्षा कार्यों वाले रोगियों के श्वसन तंत्र को उपनिवेश बनाने के लिए पाया जाता है। इस दृष्टिकोण ने पिछले अध्ययनों में वर्णित सूक्ष्म इमेजिंग प्रक्रिया को अनुकूलित किया14,20. इमेजिंग डिटेक्शन को फ्लोरेसेंस-लेबल वाली मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया द्वारा सरल बनाया गया था ताकि उनकी निकटता को तेजी से ट्रैक किया जा सके, जिसने बैक्टीरिया को भेदने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोपी कार्यभार को नाटकीय रूप से कम कर दिया। इसके अलावा, मेजबान कोशिकाओं और बैक्टीरिया की गिनती में छवियों के स्वचालित सांख्यिकीय विश्लेषण ने प्रति मेजबान कोशिका के पालनीय बैक्टीरियल काउंट के अनुपात का अनुमान लगाने के लिए बैक्टीरियल सीएलयू प्लेटिंग के हाथ से प्रयोग को बदल दिया। इस विधि की अनुकूलता की पुष्टि करने के लिए, कई बैक्टीरियल उपभेदों और मेजबान सेल प्रकारों का भी परीक्षण किया गया है, जैसे लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, बैसिलस सेरियस, और क्लेबसिएला निमोनिया, साथ ही मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVECs) की तरह, और परिणाम विधि की विविधता और प्रभावशीलता का समर्थन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल मेजबान कोशिकाओं के लिए जीवाणु लगाव की गणना के लिए एक स्वचालित दृष्टिकोण का वर्णन करता है । वर्णित दृष्टिकोण पारंपरिक तरीकों पर कई आकर्षक लाभ है। सबसे पहले, यह दृष्टिकोण माइक्रोबियल रोगजनक ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम बायोटेक इंक के डॉ काइट Zlotkowski उनके तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं । इस काम को रक्षा विभाग द्वारा अनुबंध संख्या W911NF1920013 के तहत पीडीएफ, डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (DARPA) और अनुबंध संख्या 140D6319C029 के तहत आंतरिक विभाग द्वारा पीडीएफ को समर्थन दिया गया था। सूचना की विषयवस्तु सरकार की स्थिति या नीति को आवश्यक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करती है और किसी आधिकारिक समर्थन का अनुमान नहीं लगाया जाना चाहिए ।
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
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