Summary
Mevcut protokol, yapay bir ortam kullanarak delici emen böceklerden yeterli tükürük toplama yöntemini açıklar. Bu, böcek tükürüğü toplamak ve böcek besleme davranışı ve vektör kaynaklı virüs iletimi üzerinde tükürük fonksiyonunu incelemek için uygun bir yöntemdir.
Abstract
Doğu Asya'da önemli ekonomik tarım kaybına neden olan pirinç şerit virüsü (RSV), konak pirinç arasında etkili bulaşması için tamamen böcek vektörlerine bağlıdır. Laodelphax striatellus (küçük kahverengi planthopper, SBPH), phloem'den özsuyu emerken RSV'yi yatay olarak ileten birincil böcek vektörüdür. Tükürük, böceklerin beslenme davranışında önemli bir rol oynar. Piercing emici beslenme davranışı ile böceklerin tükürüğü üzerinde araştırma için yararlı olacak uygun bir yöntem burada açıklanmıştır. Bu yöntemde, böceklerin iki gerilmiş parafin film katmanı arasında sıkışmış yapay bir diyetle beslenmesine izin verildi. Tükürüğü içeren diyet her gün toplandı, filtrelendi ve daha fazla analiz için konsantre edildi. Son olarak protein boyama ve immünblotting ile toplanan tükürüğün kalitesi incelendi. Bu yöntem, SBPH tükürüğünde RSV ve mucin benzeri bir proteinin varlığı tespit ederek örneklenmiştir. Bu yapay beslenme ve tükürük toplama yöntemi, beslenme davranışı ve virüs bulaşmasıyla ilgili böcek tükürüğündeki faktörler hakkında daha fazla araştırma için bir temel atacaktır.
Introduction
Pirinç şerit virüsü (RSV), Tenuivirüscinsinde negatif iplikli bir RNA virüsü , Doğu Asya'da pirinç üretiminde ağır hastalıklara neden olur1,2,3. RSV'nin enfekte pirinç bitkilerinden sağlıklı olanlara iletilmesi, RSV'yi kalıcı-yayılmacı bir şekilde ileten laodelphax striatellus başta olmak üzere böcek vektörlerine bağlıdır. SBPH, RSV ile enfekte olmuş bitkilerle besledikten sonra virüsü alır. Böceğin içine girdikten sonra, RSV beslenmeden bir gün sonra midgut epitel hücresini enfekte eder ve daha sonra hemolimf'e nüfuz etmek için midgut bariyerinden geçer. Daha sonra, RSV hemolimf yoluyla farklı dokulara yayılır ve daha sonra yayılır. Satın alma sonrası yaklaşık 10-14 günlük gizli bir süre sonra, tükürük bezinin içindeki virüs salgılanan tükürük yoluyla sağlıklı konakçı bitkilere bulaşabilirken, SBPH phloem 4 , 5 ,6,7,8, 9,10'dan özsuyu emer. . Etkili bir beslenme süreci ve tükürükteki çeşitli faktörler, RSV'nin böcekten konak bitkiye yayılması için gereklidir.
Tükürük bezleri tarafından salgılanan böcek tükürüğün böceklere, virüslere ve konak bitkilere aracılık ettiğine inanılmaktadır. Hemipteran böcekleri genellikle iki tür tükürük üretir: jelleşme tükürüğü ve sulu tükürük11,12,13. Jelleşme tükürüğü esas olarak konak hücreler arasında stylet hareketini sürdürmek için apoplazmaya salgılanır ve ayrıca bitki direncinin ve bağışıklık tepkilerinin üstesinden gelmekle ilgilidir14,15,16,17. Beslenmenin problama aşamasında, böcekler aralıklı olarak bir yüzey flanşı oluşturmak için hemen oksitlenen jelleşme tükürüğü salgılarlar. Daha sonra, tek veya dallı kılıtlar, borulu bir kanal18 , 19,20rezerve etmek için stiliti kaplar. Epidermis üzerindeki yüzey flanşının, bir bağlantı noktası olarak hizmet ederek stylet'in penetrasyonunu kolaylaştırdığı varsayılırken, stylet etrafındaki kılıfalar mekanik stabilite ve yağlamasağlayabilir 16,21,22,23. Nlshp, tükürük kılıfı oluşumu ve kahverengi planthopper'ın(Nilaparvata lugens, BPH) başarılı beslenmesi için gerekli bir protein olarak tanımlandı. Yaprak biti Acyrthosiphon pisum tarafından salgılanan yapısal kılıt proteininin (SHP) ekspresyonunun inhibisyonu, konak elek tüplerinden beslenmeyi bozarak üremesini azalttı24. Ayrıca, bazı böcek türlerinde, jel tükürük faktörlerinin otçul ilişkili moleküler desenler (HAMP' ler) oluşturarak bitki bağışıklık yanıtlarını tetiklemesi gerekir. N. lugens, NlMLP, kılıfa bağlı bir mucin benzeri protein, hücre ölümü, savunma ile ilgili genlerin ekspresyözü ve callose birikimi de dahil olmak üzere beslenmeye karşı bitki savunmasını teşvik eder 25,26. Ayrıca, yaprak bitlerindeki bazı jel tükürük faktörlerinin patojenle ilişkili moleküler desenlere benzer genden gene etkileşimler yoluyla bitki savunma yanıtlarını tetiklediği kanıtlanmıştır12,15,27.
Böcek besleme ve / veya patojen iletimi için gerekli tükürük faktörlerini incelemek için, salgılanan tükürüğü analiz etmek gerekir. Burada, yeterli miktarda tükürük elde etmek için yapay beslenme ve toplama yöntemleri daha fazla analiz için açıklanmıştır. Sadece tek bir besin öğesi içeren bir ortam kullanılarak, birçok tükürük proteini gümüş boyama ve batı şişkinliği ile toplandı ve analiz edildi. Bu yöntem, SBPH tarafından RSV iletimi için gerekli olan tükürük faktörleri üzerinde daha fazla araştırmada yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SBPH bakımı
- Virülifer ve RSV içermeyen SBPH bireylerini, laboratuvarda cam oda başına 5-6 pirinç(Oryza sativa cv. Nipponbare) fidesi ile bir cam inkübatörde (65 x 200 mm) arkalayın. Pirinç bitkilerini 25 °C'de 16 saat açık / 8 saat koyu fotoperiyod altında yetiştirin.
NOT: Virülifer ve RSV içermeyen SBPH bireyleri başlangıçta Jiangsu Eyaleti, Çin'de yakalandı. - SBPH'deki RSV'nin, RSV ribonucleoproteinlerine (RNP' ler) karşı yükseltilmiş tavşan RSV'ye özgü poliklonal antikor (bkz. Malzeme Tablosu)ile nokta enzime bağlı immünosorbent testi (dot-ELISA) ile tespit edin.
NOT: Yüksek yavru enfeksiyon verimliliğini sağlamak için virülifer dişiler ayrı ayrı muhafaza edildi ve yavrularının% 15'i RSV enfeksiyonu için rastgele test edildi. Dot-ELISA'nın ayrıntıları 1.3-1.7 adımlarında açıklanmıştır. - Tek SBPH'yi 20 μL kaplama tamponunda homojenize edin (0,05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9,5). Naylon membran üzerinde her birinin 3 μL'sini tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu)ve ardından membranı oda sıcaklığında (RT) kurutun.
- Membranı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 15 mL blokaj tamponu (PBS + % 3 yağsız süt) ile kuluçkaya yatırın.
- Rt'de 1 saat boyunca 15 mL PBS'de RSV'ye (1:10000) karşı seyreltilmiş birincil tavşan antikorları ile membranı kuluçkaya yatırın ve membranı her seferinde 5 dakika inkübasyon için PBS ile üç kez yıkayın.
- Membranı 15 mL PBS'de 1,5 μL yaban turpu peroksidaz konjuge keçi anti-tavşan antikorları ile kuluçkaya yatırın (bkz. Malzeme Tablosu)ve her seferinde 5 dakika inkübasyon için PBS ile üç kez yıkayın.
- Üretici tarafından sağlanan protokollere göre Geliştirilmiş HRP-DAB Kromojenik Kit (bkz. Malzeme Tablosu)ile immünoblotları geliştirin.
2. Beslenme odası ve yapay diyetin hazırlanması
- 2 g sakkaroz tozunun ağırlığını haline getirin ve yapay diyet olarak% 5 sakkaroz sulu çözeltisi hazırlamak için 40 mL ddH2O'da çözün.
- Bakteriyel kirlenmeyi ve safsızlıkları gidermek için çözeltiyi 0,22 μm filtreden (bkz. Malzeme Tablosu)filtreleyin.
- 200 3rd-5th SBPH larvalarını odaya sokmadan önce 3-5 saat boyunca aç bırakın.
NOT: Bir oda için 200 SBPH hazırlanır; birkaç oda için daha fazla SBPH hazırlanmalıdır. - Cam silindirleri besleme odaları olarak hazırlayın (Şekil 1A). Deneysel böcekleri tanıtmadan önce odanın bir açık ucunu bir parafin zarı ile örtün (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Her silindir 15,0 cm uzunluğunda ve 2,5 cm çapındadır. Bu cam silindirler deneysel iddaa göre özel olarak yapılmıştır. - Böcekleri bir cam silindire aktarın.
- Odanın diğer ucunu gerilmiş parafin zarı ile örtün (özellikle Parafilm M). Ardından, içine 200 μL yapay diyet ekleyin. Son olarak, sıvıyı başka bir gerilmiş parafin zarı tabakası ile örtün.
NOT: Parafin zarı orijinal alanının yaklaşık iki katına kadar gerilir. - Odayı alüminyum folyo ile örtün, ancak ucu ışığa maruz kalan yapay diyet cihazıyla bırakın.
3. SBPH tükürük koleksiyonu
- RSV içermeyen ve virülifer SBPH'den yapay diyeti 24 saatin sonunda ayrı ayrı toplayın.
- Böcekleri hareketsiz hale getirmek için silindiri 4 °C'de soğutun.
- Dış filmi ortaya çıkarın ve steril bir pipet kullanarak yapay diyet sıvısını 1,5 mL steril tüplere toplayın. Toplanan tükürüğü analize kadar -80 °C'de tutun.
NOT: Toplanan tükürük 1 yıl boyunca -80 °C'de saklanabilir. - İç zarı 50 μL taze yapay diyetle üç kez yumuşak bir şekilde pipetle çalkalayın ve 3.3 adımda açıklandığı gibi yapay yıkama diyetini toplayın. Yeni yapay diyeti iç zara yerleştirin ve üzerine taze gerilmiş bir Parafin zarı tutun.
- 3.2 ve 3.3.
NOT: Yapay besleme SBPH'nin hayatta kalma oranını sayın ve hayatta kalma oranına göre yeterli taze SBPH takviyesi sağlayın. - Mikropları ve diğer kirleticileri gidermek için toplanan numuneleri 0,22 μm filtre ünitesinden filtreleyin.
4. Toplanan tükürüğün konsantrasyonu
- Toplanan tükürük örneklerini 0,5 mL 10 kD santrifüj filtreye aktarın (bkz. Malzeme Tablosu) ve 20 dakika boyunca 4 °C'de 5.500 x g'da döndürün. Üst yapıyı toplayın ve son hacmi 100 μL'ye yapın.
- 4.3-4.6 adımlarını izleyerek uygun bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak toplanan tükürüğün konsantrasyonunu ölçün.
- Spektrofotometreyi açın ve kaideleri ddH2O ile üç kez yıkayın.
- Ekranda aşağıdaki seçenekleri uygun sırayla seçin: Proteinler | Protein A280 | Yazım |'ni seçin 1 Abs = 1 mg/mL. Ardından, Temel Düzeltme 340 nmonay kutusunu işaretleyin.
- %5 sakkaroz sulu çözeltisinin 2 μL'sini boş olarak yükleyin, ekranın altındaki Boş'a dokunun.
- Standartları belirledikten sonra, ölçüm için toplanan tükürüğün 2 μL'sini yükleyin. Protein konsantrasyonunu okuyun ve kaydedin.
NOT: Sonunda toplamda en az 1 mg tükürük proteini toplandı.
5. Tükürük proteinlerinin gümüş lekesi
- Örnek yükleme tamponu (50 mM Tris-HCl pH 6.8, %10 gliserol, %2 SDS, %0.1 bromofenol mavisi ve %1 β-mercaptoethanol) kullanarak böcek tükürüğü örneklerinden protein çıkarın. Ardından, %10 SDS-PAGE (bkz. Malzeme Tablosu) ile kesirlenin. %5'lik sukroseaqueous çözeltisini negatif kontrolle aynı şekilde yükleyin.
- Numunenin 20 μL'lik bir aliquot'ını önceden belirlenmiş bir işaretleyicinin yanında bir SDS-PAGE jeline yükleyin. Jeli 90 Volt'ta 15 dakika, sonra 140 Volt'ta 50 dakika çalıştırın.
- Jeli elektroforezden sonra en az 30 dakika boyunca% 30 (vol/ vol) etanol, % 10 (vol/ vol) asetik asitte sabitle.
- Jeli iki kez% 20 (vol / vol) etanol ve her seferinde 10 dakika ayrı ayrı su ile durulayın.
- Jeli 0,8 mM sodyum tiyosülfatta 1 dakika hassaslaştırın ve ardından her seferinde 1 dakika suda iki kez durulayın.
- Jeli en az 1 saat boyunca 12 mM gümüş nitrata batırın ve ardından geliştirici çözümüne aktarmadan önce 10 sn deiyonize suya batırın.
- Jelin arka planı karardığında, reaksiyonun durması için jeli en az 30 dakika boyunca bir durdurma çözeltisine (% 5 asetik asit) daldırın.
- Jeli her seferinde 30 dakika suyla iki kez yıkayın. Görüntüyü Algılama Sistemi ile geliştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
6. Batı şişkinliği ile protein tespiti
- SBPH (LssgMP) ve RSV'nin tükürük musin benzeri proteinini sırasıyla spesifik antikorlar kullanarak batı lekeleri tarafından tespit edin.
- Adım 5.1'i takiben böcek tükürük örneklerini tedavi edin.
- Numunenin 20 μL'lik bir aliquot'unu% 10 SDS-PAGE jeline, önceden belirlenmiş bir işaretleyiciye ve negatif kontrol olarak 20 μL RSV enfekte olmayan tükürük örneğine yükleyin. Jeli 90 Volt'ta 15 dakika, sonra 140 Volt'ta 50 dakika çalıştırın.
- 100 mL 10x protein transfer tamponunu (ıslak) (bkz. Malzeme Tablosu)900 mL ddH2O ile bir iş çözeltisine (1x) karıştırın ve protein transfer tamponu (1x) kullanarak proteinleri bir polivinylidene difluorid membranına aktarın.
- Membranı oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca %0,05 Ara 20 (TBST) ile 0,01 M Tris tamponlu salin ile %5 yağsız sütte engelleyin.
NOT: Bu protokolde, 100 mL 10x TBST 'yi (bkz. Malzeme Tablosu)900 mL ddH2O ile iş çözümüne karıştırın. - Rt'de TBST'de en az 2 saat seyreltilmiş RSV veya LssgMP'ye (her ikisi de 1:10000) karşı birincil tavşan antikorları ile membranı kuluçkaya yatırın.
NOT: RSV'ye karşı primer antikorların üretiminden yukarıda bahsedilmiştir. Bir biyoteknoloji şirketi, LssgMP peptid GIQFDSYSASDLTRC'ye karşı tavşan anti-LssgMP poliklonal antikorunu üretti. - Membranı her seferinde 10 dakika inkübasyon için TBST ile üç kez yıkayın.
- Membranı 1:10000 TBST'de seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz konjuge keçi anti-tavşan antikorları ile kuluçkaya yatırın.
- Gelişmiş chemiluminescence Western Blotting Algılama Sistemi ile immünoblotları geliştirin.
7. SBPH'de LssgMP ifade deseninin algısı
- Böcekleri 4 °C'de 5 dakika hareketsiz hale ederim.
- Böcekleri% 75 etanol ve ddH2O ile tek tek yıkayın ve ardından böcekleri önceden soğutulmuş TBS'de (0,01 M Tris tamponlu salin) parçalara ayrıştırın.
- Coxa-trochanter ekleminde SBPH'nin foreleglerini forseps ile keserken böcekleri karından parçalara ayırma; hemolimften herhangi bir kirlenmeyi gidermek için midgut ve tükürük bezlerini TBS'de iki kez yıkayın.
- RNA çıkarmak için 1,5 mL RNaz içermeyen bir tüpe beş doku koyun. Her tüpü tek bir örnek olarak düşünün.
- Üreticinin protokollerine ve Ters transkripsiyonlu PCR'ye (RT-PCR) göre RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Tüm vücudun özlerinde veya L. striatellus'unçeşitli dokularında LssgMP'nin göreli transkript ifade seviyelerini araştırmak için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirin.
NOT: Gen amplifikasyonu için kullanılan astar çiftleri LssgMP-q-F/LssgMP-q-R idi, SYBR Yeşil tabanlı qPCR üreticinin protokolüne göre gerçekleştirildi. L. striatellus çeviri uzama faktörü 2 (ef2)transkript seviyesi, cDNA şablonlarının normalleştirilmesi için astar çifti ef2-q-F/ef2-q-R ile ölçüldü. Ve astar dizileri aşağıda eklenmiştir:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yapay besleme kurulumu ve tükürük toplama şemaları
Şekil 1A, tükürüğü toplamak için besleme odası olarak kullanılan cam silindiri (15 cm x 2,5 cm) tasvir eder. İlk olarak, SBPH larvaları toplama verimliliğini artırmak için birkaç saat aç bırakıldı ve daha sonra 5 dakika soğutularak hareketsiz hale getirildi. Böcekler cam silindire aktarıldıktan sonra, odanın her iki açık ucu gerilmiş Parafin zarı ile kaplandı. Bir uçta, 200 μL% 5 sakkaroz, orijinal alanının yaklaşık iki katına uzatılmış iki Kat Parafin zarı arasına sıkışmıştır (Şekil 1B). Oda folyo ile kaplıydı, ancak yapay diyetle sona erdi. SBPH fototropik davranış sergilediğinden, sonunda toplanan aç böcekler ışığa maruz kaldı ve gerilmiş iç Parafin zarı aracılığıyla yapay diyet çözeltisi ile beslendi. Buna dayanarak, tükürük her gün toplanan yapay diyete salınabilir. Parafilm-diyet cihazı her gün yenisiyle değiştirildi. Bu şekilde, yapay diyet 5 gün ila 2 hafta boyunca toplandı ve daha sonra tüm örnek 10 KD santrifüj filtre kullanılarak 100 μL'lik son bir hacme konsantre edildi (Şekil 1C). Tükürük toplama sırasında, SBPH'nin% 5 sakkaroz besleme oranı sayıldı. İlk 4 günde% 80'den fazla SBPH hayatta kaldı. Bununla birlikte,5. günden itibaren mortalite hızla artarak % 40'a ulaştı ve SBPH'ninyarısındanazı 7. Yeterli tükürük toplamak için, tazeSBPH'nin 4.
Toplanan tükürük proteinlerinin doğrulanması
Bu toplama yönteminin etkinliğini değerlendirmek için tükürük örneği protein analizine tabi tutuldu. İlk olarak, proteinler SDS-PAGE ile ayrıldı ve daha sonra gümüş boyama ile tespit edildi (Şekil 2A). Negatif kontrol (%5 sakkaroz) ile karşılaştırıldığında, RSV ile enfekte SBPH tükürükten alınan konsantre tükürük örnekleri, örneğin kütle spektrometresi ile daha fazla analiz edilebilen birçok protein içeriyordu. RSV'nin birincil böcek vektörü olan SBPH, emme delici besleme işlemi ile virüsü bitkilere iletir. RSV'nin başarılı bir şekilde salınmasının tükürük salgılanmasıyla ilgili olduğu ve RSV'nin virülifer böceklerin tükürüğünde önemli bir faktör olduğu düşünülmektedir. Burada, tükürük, enfekte olmayan ve virülifer böcekleri RSV'ye karşı bir antikorla topladıktan sonra test edildi ve virülifer numunesinde RSV kat proteinini (CP) başarıyla tespit etti (Şekil 2B). Başka bir çalışma, müsin proteinlerinin hemipteran böceklerde23beslemek için bir kılıt oluşumunu meditasyon yapmak için gerekli jel tükürük proteinleri olduğunu buldu. SBPH'nin aynı zamanda bir mucin proteini ürettiğini doğrulamak için, yatıştırıcı bir musin kodlayıcı genin tüm açık okuma çerçevesi, SBPH'nin tükürük bezinden çıkarılan RNA'dan yükseltildi. Dizisi, SBPH28'ingenom dizisine karşı BLAST analizlerinde sorgu olarak kullanılmıştır. LssgMP adlı 2175 bp'den oluşan bir gen tanımlandı. Bu proteine karşı bir antikor daha önce hazırlanmış ve toplanan numunedeki proteini batı leke analizi ile tespit etmek için kullanılmıştır. Enfekte olmayan ve virülifer örneklerde LssgMP'nin tükürük proteini olduğunu gösteren 78 KD protein tespit edildi (Şekil 2C). Daha sonra, LssgMP'nin farklı dokulardaki transkript düzeyleri (tükürük bezi, bağırsak ve kalan vücut) qRT-PCR ile belirlendi. Sonuçlar, gen transkript seviyesinin tükürük bezinde bağırsak ve diğer vücut parçalarına göre 20 kat daha yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 2D), tükürük bezinde LssgMP'nin spesifik ifadesini doğrulamamıştır.
Şekil 1: SBPH'nin yapay diyette beslenmesine izin vermek için Parafin membranlı sandviç ile besleme odası şeması. (A) Yapay beslenme odasının illüstrasyonu. Silindir 15,0 cm uzunluğunda ve 2,5 cm çapındadır. Odanın bir ucunda Parafin membran sandviçi var; diğer ucu ve kalay folyo kağıdı (eğimli çizgiler) ile kaplı silindir duvarı, kalay folyo kağıdı ile kaplı cihazı temsil eder. Işık kaynağı, yapay diyetle beslenmek için SBPH'yi çekecek şekilde ayarlandı. (B) Yapay diyet içeren Parafin sandviç şeması. %5 sakkaroz sulu çözeltisinin 200 μL'si, orijinal alanının yaklaşık iki katına kadar uzatılmış iki kat Parafin membran arasına sıkışmıştır. (C) 10 KD santrifüj filtre kullanılarak toplanan tükürüğün konsantrasyonu. (D) SBPH'nin %5 sakkarozla beslenme oranı. Ortalama ve SEM, üç teknik kopya ile dört biyolojik kopyadan hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Toplanan tükürük proteinlerinin doğrulanması. (A) Gümüş boyama ile tükürük proteinleri tespiti. %5 sakkaroz negatif kontroldür. (B) Toplanan tükürükte pirinç şeritli virüs kat proteininin (CP) batı leke analizi ile tespiti. (C) Toplanan tükürükte LssgMP varlığını doğrulamak için Batı şişkinliği. (D) L. striatellustükürük bezinde LssgMP'nin spesifik ifadesi. ef2: SBPH'nin çeviri uzama faktörü 2. Ortalama ve SEM, üç teknik kopya ile dört biyolojik kopyadan hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yapay diyetlerde böceklerin başarılı yetiştirimi ilk olarak 1962'de Mittler ve Dadd'ın yapay bir diyet tutmak için Parafin zarı tekniğini tarif ettiği zamanbildirilmiştir 29,30. Ve bu yöntem, böcek biyolojisi ve davranışının birçok yönüyle, örneğin besin takviyesi, dsRNA beslemesi ve virüs kazanımı gibi araştırıldı. Tükürük analizinin gerekliliklerine dayanarak, bu çalışmada SBPH tükürüğü toplamak için genel yapay diyet olarak% 5 sakkaroz kullanılmaktadır. Başarılı tükürük toplama için, burada birkaç kritik adıma dikkat etmek gerekir. İlk olarak, deneysel böcekleri odaya sokmadan önce aç bırakmak, tükürük toplama verimliliğini sağlamak için gereklidir. İkincisi, stil ortamını taklit etmek için iki katmanlı bir Parafin sandviçi yapılır. SBPH yapay diyetle beslendiğinde, tükürük kılıfı diyete bakan iç uçta oluşur ve sulu tükürük daha sonra salgılanır. Üçüncü olarak, toplanan numunedeki mikrobiyal kontaminasyonu azaltmak için yapay bir ortam zamanında toplanmalı ve değiştirilmelidir. Son olarak, böcekleri 4 °C'de 5 dakika boyunca uyuşturmak, yapay diyeti değiştirirken böceklerin kaybını önlemek için gereklidir.
Amino asitler, vitaminler ve karbonhidratlar içeren çoğu yapay diyetin aksine,% 5 sakkaroz ortamının avantajları dikkat çekicidir. İlk olarak, hazırlanması kolaydır. İkincisi, diyetin basit bileşimi, tükürükteki çeşitli faktörlerin daha fazla analizini müdahale etmek için az sayıda madde anlamına gelir. Bununla birlikte, SBPH'nin sağkalım oranı, genel yapay diyet olarak% 5 sakkaroz kullanılarak beslenme döneminin son günlerinde azaldı (Şekil 1D). Bu kusurun üstesinden gelmek için, yeterli tükürük için zamanında taze SBPH sağlanmalıdır. Ve beslenme davranışı veya virüs bulaşmasında tükürük fonksiyonunun daha fazla araştırılması için tükürük toplama süresi, böceklerin ölüm oranı yetersizlik nedeniyle artmadan önceki doğru zamanla sınırlanmalıdır. Yapay ortamın ortak bir sınırlaması gibi görünüyor. Diğer bazı çalışmalar, kimyasal olarak tanımlanmış D-97 diyetinde yetiştirilen N. lugens'in hayatta kalmasının, hassas pirinç çeşidi TN1'de yetiştirilenlerden daha düşük olduğunu ve orijinal konağın gıda vektör böceklerinden daha fazlasını sağladığını ima ettiğini buldu. Ve çeşitli çalışmalar, yetiştirme verimliliğini artırmak için böceklerin sürekli beslenmesi için kimyasal olarak tanımlanmış diyetleri optimize etmeye odaklanmıştır.
Tükürük bezinin transkriptom analizi tükürük proteini tanımlama için geleneksel bir yöntemdir. Ve aynı A. pisum ve M. persicae14,31türlerinde farklı tükürük proteinleri tespit edilmiştir ve tükürük proteinlerinin bolluğu tespit sıklığını belirler32. Bununla birlikte, tükürükteki şüpheli proteini araştırmak için geçerli bir yöntem eksikti. Bu Parafin membran sandviç yöntemi, LssgMP(Şekil 2C)tespit edilerek daha da kanıtlanmış olan transkriptom analizi ile tanımlanan şüpheli bir tükürük proteinini doğrulamak için yenilikçi bir yol sağlar. Ayrıca, protein analizi toplanan tükürükte bol miktarda protein bulunduğunu doğruladı (Şekil 2A), bu da örneğin kütle spektrometresi tarafından daha fazla analiz için yeterli bir miktardır. Toplanan tükürüğün proteomik analizi, SBPH'nin beslenme aşamasında yer alan salgılanan faktörleri belirlemek için doğrudan ve etkili bir yöntem olacak ve yanlış-pozitif yedekli proteinlerin tespit edilmesi riskini en aza indirecektir.
Tükürük, böcekten konak bitkilere virüs taşıyıcısı olarak çalışır ve vektör-virüs-bitki etkileşiminin önemli bir bileşenidir14,33,34. Böcek vektörlerinden salınan virüsün titresi, konakçıya enfeksiyon için çok önemli bir faktördür. Enfekte bitkilerde viral titreyi test eden dolaylı yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol virülifer SBPH (Şekil 2B)tarafından salınan RSV'yi doğrudan tespit edebilir. Bu Parafin membranlı sandviç yöntemi ile desteklenen, RSV içermeyen ve RSV ile enfekte böceklerden toplanan tükürük proteinlerinin daha karşılaştırmalı analizleri, virüs-bitki-vektör etkileşiminde yer alan potansiyel adayları da ortaya gösterebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (No. 2019YFC1200503), Çin Ulusal Bilim Vakfı (No. 32072385) ve Gençlik İnovasyonu Teşvik Derneği CAS (2021084) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
References
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
- He, M., Guan, S. Y., He, C. Q.
- Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
- Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
- Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
- Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
- Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
- Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
- Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
- De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
- Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
- Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
- Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
- Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
- Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
- Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
- Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
- Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
- Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
- Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
- Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
- Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
- Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
- Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).
