Analysera oxidativ stress i Murine Intestinala organoider med hjälp av reaktiva syre arter-känslig fluorogen sond
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att upptäcka reaktiva syre arter (ROS) i intestinala murine organoider med kvalitativ avbildning och kvantitativa cytometri analyser. Detta arbete kan potentiellt utvidgas till andra fluorescerande sonder för att testa effekten av valda föreningar på ROS.
Abstract
Reaktiva syrearter (ROS) spelar viktiga roller i intestinal homeostas. ROS är naturliga biprodukter av cellmetabolism. De produceras som svar på infektion eller skada på slemhinnan eftersom de är involverade i antimikrobiella svar och sårläkning. De är också kritiska sekundära budbärare, som reglerar flera vägar, inklusive celltillväxt och differentiering. Å andra sidan leder överdrivna ROS-nivåer till oxidativ stress, vilket kan vara skadligt för celler och gynna tarmsjukdomar som kronisk inflammation eller cancer. Detta arbete ger en enkel metod för att upptäcka ROS i intestinala murin organoider genom levande imaging och flöde cytometri, med hjälp av en kommersiellt tillgänglig fluorogen sond. Här beskriver protokollet att analysera effekten av föreningar som modulerar redoxbalansen i intestinala organoider och detekterar ROS-nivåer i specifika tarmcellstyper, exemplifierat här av analysen av tarmstamcellerna genetiskt märkta med GFP. Detta protokoll kan användas med andra fluorescerande sonder.
Introduction
Reaktiva syrearter (ROS) är naturliga biprodukter av cellulär metabolism. De kan också aktivt produceras av specialiserade enzymatiska komplex som membranbundna NADPH-Oxidaser (NOX) och Dual Oxidases (DUOX), som genererar superoxid anjon och väteperoxid1. Genom att uttrycka antioxidantenzymer och ROS-asätare kan cellerna finjustera sin redoxbalans och därmed skydda vävnadshomeostas2. Även om ROS kan vara mycket giftigt för cellerna och skada DNA, proteiner och lipider, är de avgörande signalmolekyler2. I tarmepitelet krävs måttliga ROS-nivåer för stam- och stamceller spridning3; höga ROS nivåer leder till deras apoptos4. Kronisk oxidativ stress är kopplad till många gastrointestinala sjukdomar, såsom inflammatoriska tarmsjukdomar eller cancer. Som ett exempel, i en musmodell av Wnt-driven tarmcancer, förhöjd ROS produktion genom aktivering av NADPH-oxidaser konstaterades krävas för cancerceller hyperproliferation5,6. Att definiera hur tarmceller, särskilt stamceller, hanterar oxidativ stress och hur cellmiljön kan påverka denna kapacitet är avgörande för att förstå etiologin för denna sjukdom bättre7.
I en vävnad uppvisar olika celltyper ett basalt oxidativt tillstånd som kan variera beroende på deras funktion och ämnesomsättning och uttrycket av olika nivåer av oxidant- och antioxidantmolekyler4,7. Övervakning av ROS in vivo är mycket utmanande. Cellgenomsläppliga färgämnen som avger fluorescens enligt deras redoxtillstånd har utvecklats för att visualisera och mäta cellulär ROS i levande celler och djur. Deras effektivitet beror dock på deras diffusion inuti levande vävnader och deras snabba avläsning, vilket gör dem svåra att använda i djurmodeller8.
Tidigare gjordes studien av effekten av föreningar på ROS-generering med hjälp av cellinjer, men detta kanske inte återspeglar in vivo-situationen . Den intestinala organoidmodellen, utvecklad av gruppen Clevers9, möjliggör tillväxt av intestinala primärceller ex vivo. Kultur av intestinala krypter i matriser, i närvaro av definierade tillväxtfaktorer, leder till tredimensionella strukturer, kallade organoider (mini-gut), som reproducerar crypt-villus-organisationen, med celler från de olika epitelerna som fodrar en inre lumen och tarmstamcellerna som bor i små krypterliknande utskjutningar.
Här, dra nytta av denna modell, beskrivs en enkel metod för att studera oxidativ stress i primära tarmceller vid encellsupplösningen genom att lägga till ett kommersiellt tillgängligt ROS-känsligt färgämne i det organoida odlingsmediet.
Plattläsare används ofta för att upptäcka ROS-produktion i en total population. Detta protokoll använder flödescytometri eller avbildningsanalys för att detektera ROS i en viss celltyp med genetiskt modifierade celler eller specifik antikroppsfärgning. Detta arbete omfattar mus intestinal organoid kultur och ROS visualisering genom confocal imaging och kvantifiering av flöde cytometry. Med hjälp av Lgr5-GFP möss-härledda små intestinala organoider är det möjligt att specifikt analysera nivån av oxidativ stress i intestinala stamceller vid olika behandlingar. Detta protokoll kan anpassas för att testa påverkan av exogena molekyler, såsom mikrobiota-härledd muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balansen, efter att ha stimulerat organoider med de valda föreningarna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete ger ett steg-för-steg protokoll för att isolera murine jejunal krypter, odla dem i 3D organoider och analysera ROS i organoider genom att kombinera en ROS-känslig fluorogen sond med kvalitativ mikroskopi imaging av hela organoider och kvantitativ ROS mätning med flöde cytometri på enstaka celler efter organoid dissociation.
Det första kritiska steget i den här metoden är kryptextraheringsproceduren. Faktum är att kvaliteten på kryptberedning är nyckeln till framgångsr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det franska nationella forskningsorganet (ANR) anslag 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
