Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de intestinale muriene organoïden te detecteren met behulp van kwalitatieve beeldvorming en kwantitatieve cytometrie-assays. Dit werk kan mogelijk worden uitgebreid naar andere fluorescerende sondes om het effect van geselecteerde verbindingen op ROS te testen.
Abstract
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een essentiële rol in intestinale homeostase. ROS zijn natuurlijke bijproducten van het celmetabolisme. Ze worden geproduceerd als reactie op infectie of letsel op mucosaal niveau omdat ze betrokken zijn bij antimicrobiële reacties en wondgenezing. Ze zijn ook kritische secundaire boodschappers, die verschillende routes reguleren, waaronder celgroei en differentiatie. Aan de andere kant leiden overmatige ROS-niveaus tot oxidatieve stress, wat schadelijk kan zijn voor cellen en darmziekten zoals chronische ontsteking of kanker kan bevorderen. Dit werk biedt een eenvoudige methode om ROS in de intestinale muriene organoïden te detecteren door middel van live beeldvorming en flowcytometrie, met behulp van een commercieel verkrijgbare fluorogene sonde. Hier beschrijft het protocol het testen van het effect van verbindingen die de redoxbalans in intestinale organoïden moduleren en ROS-niveaus detecteren in specifieke darmceltypen, hier geïllustreerd door de analyse van de darmstamcellen genetisch gelabeld met GFP. Dit protocol kan worden gebruikt met andere fluorescerende sondes.
Introduction
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn natuurlijke bijproducten van cellulair metabolisme. Ze kunnen ook actief worden geproduceerd door gespecialiseerde enzymatische complexen zoals de membraangebonden NADPH-Oxidasen (NOX) en Dual Oxidases (DUOX), die superoxide-anion en waterstofperoxide genereren1. Door antioxiderende enzymen en ROS-aaseters tot expressie te brengen, kunnen cellen hun redoxbalans fijn afstemmen, waardoor weefselhomeostase wordt beschermd2. Hoewel ROS zeer giftig kan zijn voor de cellen en DNA, eiwitten en lipiden kan beschadigen, zijn het cruciale signaalmoleculen2. In het darmepitheel zijn matige ROS-niveaus vereist voor stam- en voorlopercelproliferatie3; hoge ROS-waarden leiden tot hun apoptose4. Chronische oxidatieve stress is gekoppeld aan veel gastro-intestinale ziekten, zoals inflammatoire darmziekten of kanker. In een muismodel van Wnt-gedreven darmkanker bleek bijvoorbeeld een verhoogde ROS-productie door activering van NADPH-oxidasen nodig te zijn voor hyperproliferatie van kankercellen5,6. Definiëren hoe darmcellen, in het bijzonder stamcellen, stamcellen omgaan met oxidatieve stress en hoe de cellulaire omgeving deze capaciteit kan beïnvloeden, is essentieel om de etiologie van deze ziekte beter te begrijpen7.
In een weefsel vertonen verschillende celtypen een basale oxidatieve toestand die kan variëren afhankelijk van hun functie en metabolisme en de expressie van verschillende niveaus van oxidant- en antioxidantmoleculen4,7. Het monitoren van ROS in vivo is een grote uitdaging. Celdoorlatende kleurstoffen die fluorescentie uitzenden volgens hun redoxtoestand zijn ontwikkeld om cellulaire ROS in levende cellen en dieren te visualiseren en te meten. Hun werkzaamheid hangt echter af van hun diffusie in levende weefsels en hun snelle uitlezing, waardoor ze moeilijk te gebruiken zijn in diermodellen8.
In het verleden werd de studie van het effect van verbindingen op ROS-generatie gedaan met behulp van cellijnen, maar dit weerspiegelt mogelijk niet de in vivo situatie. Het intestinale organoïde model, ontwikkeld door de groep van Clevers9, maakt de groei van intestinale primaire cellen ex vivo mogelijk. Cultuur van intestinale crypten in matrices, in aanwezigheid van gedefinieerde groeifactoren, leidt tot driedimensionale structuren, organoïden (mini-darm) genoemd, die de crypt-villus-organisatie reproduceren, met cellen uit de verschillende epitheliale afstammingslijnen die een intern lumen bekleden, en de darmstamcellen die zich in kleine crypten-achtige uitsteeksels bevinden.
Hier wordt, gebruikmakend van dit model, een eenvoudige methode beschreven om oxidatieve stress in primaire darmcellen met de eencellige resolutie te bestuderen door een commercieel beschikbare ROS-gevoelige kleurstof toe te voegen aan het organoïde kweekmedium.
Plaatlezers worden vaak gebruikt om ROS-productie in een totale populatie te detecteren. Dit protocol maakt gebruik van flowcytometrie of imaging assay om ROS te detecteren in een bepaald celtype met genetisch gemodificeerde cellen of specifieke antilichaamkleuring. Dit werk omvat intestinale organoïde cultuur van muizen en ROS-visualisatie door confocale beeldvorming en kwantificering door flowcytometrie. Met behulp van Lgr5-GFP muizen-afgeleide dunne darm organoïden, is het mogelijk om specifiek het niveau van oxidatieve stress in intestinale stamcellen te analyseren op verschillende behandelingen. Dit protocol kan worden aangepast om de invloed van exogene moleculen, zoals microbiota-afgeleid muramyl-dipeptide (MDP)10, op de ROS-balans te testen, na het stimuleren van organoïden met de geselecteerde verbindingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk biedt een stapsgewijs protocol om murine jejunale crypten te isoleren, ze te kweken tot 3D-organoïden en ROS in organoïden te analyseren door een ROS-gevoelige fluorogene sonde te combineren met kwalitatieve microscopiebeeldvorming van hele organoïden en kwantitatieve ROS-meting met behulp van flowcytometrie op afzonderlijke cellen na organoïde dissociatie.
De eerste kritieke stap in deze methode is de extractieprocedure voor crypten. Inderdaad, de kwaliteit van de voorbereiding v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de subsidie 17-CE14-0022 (i-Stress) van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
