Анализ окислительного стресса в кишечных органоидах мышей с использованием фторогенного зонда, чувствительного к активным формам кислорода
Summary
Настоящий протокол описывает способ обнаружения активных форм кислорода (АФК) в органоидах кишечного мыша с использованием качественной визуализации и количественных анализов цитометрии. Эта работа может быть потенциально распространена на другие флуоресцентные зонды для проверки влияния выбранных соединений на АФК.
Abstract
Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль в кишечном гомеостазе. АФК являются естественными побочными продуктами клеточного метаболизма. Они производятся в ответ на инфекцию или травму на уровне слизистой оболочки, поскольку они участвуют в антимикробных реакциях и заживлении ран. Они также являются критическими вторичными мессенджерами, регулирующими несколько путей, включая рост и дифференцировку клеток. С другой стороны, чрезмерные уровни АФК приводят к окислительному стрессу, который может быть вредным для клеток и способствовать кишечным заболеваниям, таким как хроническое воспаление или рак. Эта работа обеспечивает простой метод обнаружения АФК в органоидах кишечных мышей с помощью живой визуализации и проточной цитометрии с использованием коммерчески доступного фторогенного зонда. Здесь протокол описывает анализ влияния соединений, которые модулируют окислительно-восстановительный баланс в кишечных органоидах и обнаруживают уровни АФК в определенных типах клеток кишечника, примером чего является анализ кишечных стволовых клеток, генетически меченных GFP. Этот протокол может использоваться с другими флуоресцентными зондами.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК) являются естественными побочными продуктами клеточного метаболизма. Они также могут активно продуцироваться специализированными ферментативными комплексами, такими как мембранно-связанные NADPH-оксидазы (NOX) и двойные оксидазы (DUOX), которые генерируют супероксид анион и перекись водорода1. Экспрессируя антиоксидантные ферменты и поглотители АФК, клетки могут тонко настраивать свой окислительно-восстановительный баланс, тем самым защищая тканевый гомеостаз2. Хотя АФК может быть очень токсичным для клеток и повреждать ДНК, белки и липиды, они являются важнейшими сигнальными молекулами2. В кишечном эпителии для пролиферации стволовых и прогениторных клеток требуются умеренные уровни АФК3; высокие уровни АФК приводят к их апоптозу4. Хронический окислительный стресс связан со многими желудочно-кишечными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника или рак. Например, в мышиной модели Wnt-управляемого рака кишечника было обнаружено, что повышенная продукция АФК посредством активации NADPH-оксидаз необходима для гиперпролиферации раковых клеток5,6. Определение того, как кишечные клетки, в частности стволовые клетки, стволовые клетки управляют окислительным стрессом и как клеточная среда может влиять на эту способность, имеет важное значение для лучшего понимания этиологии этого заболевания7.
В ткани различные типы клеток представляют базальное окислительное состояние, которое может варьироваться в зависимости от их функции и метаболизма, а также экспрессии различных уровней молекул окислителя и антиоксиданта4,7. Мониторинг ROS in vivo очень сложен. Клеточные проницаемые красители, которые излучают флуоресценцию в соответствии с их окислительно-восстановительным состоянием, были разработаны для визуализации и измерения клеточного АФК в живых клетках и животных. Однако их эффективность зависит от их диффузии внутри живых тканей и их быстрого считывания, что затрудняет их использование на животных моделях8.
В прошлом изучение влияния соединений на генерацию АФК проводилось с использованием клеточных линий, но это может не отражать ситуацию in vivo . Кишечная органоидная модель, разработанная группой Clevers9, обеспечивает рост первичных клеток кишечника ex vivo. Культивирование кишечных крипт в матрицах, в присутствии определенных факторов роста, приводит к трехмерным структурам, называемым органоидами (мини-кишечник), которые воспроизводят крипто-ворсинчатую организацию, с клетками из разных эпителиальных линий, выстилающих внутренний просвет, и кишечными стволовыми клетками, находящимися в небольших криптоподобных выступах.
Здесь, используя преимущества этой модели, описан простой метод изучения окислительного стресса в первичных клетках кишечника с одноклеточным разрешением путем добавления коммерчески доступного АФК-чувствительного красителя в органоидную культуральную среду.
Пластинчатые считыватели часто используются для обнаружения производства АФК в общей популяции. Этот протокол использует проточную цитометрию или визуальный анализ для обнаружения АФК в определенном типе клеток с генетически модифицированными клетками или специфическим окрашиванием антител. Эта работа включает в себя культуру органоидов кишечника мышей и визуализацию АФК путем конфокальной визуализации и количественной оценки с помощью проточной цитометрии. Используя органоиды тонкого кишечника, полученные от мышей Lgr5-GFP, можно специально проанализировать уровень окислительного стресса в кишечных стволовых клетках при различных методах лечения. Этот протокол может быть адаптирован для проверки влияния экзогенных молекул, таких как мурамил-дипептид (MDP)10, полученных из микробиоты, на баланс АФК, после стимуляции органоидов выбранными соединениями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа предоставляет пошаговый протокол для выделения мышиных точевидных крипт, культивирования их в 3D-органоиды и анализа АФК в органоидах путем объединения ФТОРогенного зонда, чувствительного к АФК, с качественной микроскопической визуализацией целых органоидов и количествен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Французского национального исследовательского агентства (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
