Análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies reactivas de oxígeno
Summary
El presente protocolo describe un método para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) en los organoides murinos intestinales utilizando imágenes cualitativas y ensayos de citometría cuantitativa. Este trabajo se puede extender potencialmente a otras sondas fluorescentes para probar el efecto de compuestos seleccionados en ROS.
Abstract
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel esencial en la homeostasis intestinal. Las ROS son subproductos naturales del metabolismo celular. Se producen en respuesta a una infección o lesión a nivel de la mucosa, ya que están involucrados en las respuestas antimicrobianas y la cicatrización de heridas. También son mensajeros secundarios críticos, que regulan varias vías, incluido el crecimiento y la diferenciación celular. Por otro lado, los niveles excesivos de ROS conducen al estrés oxidativo, que puede ser perjudicial para las células y favorecer enfermedades intestinales como la inflamación crónica o el cáncer. Este trabajo proporciona un método sencillo para detectar ROS en los organoides murinos intestinales mediante imágenes en vivo y citometría de flujo, utilizando una sonda fluorogénica disponible comercialmente. Aquí el protocolo describe el ensayo del efecto de los compuestos que modulan el equilibrio redox en organoides intestinales y detectan los niveles de ROS en tipos específicos de células intestinales, ejemplificado aquí por el análisis de las células madre intestinales genéticamente marcadas con GFP. Este protocolo se puede utilizar con otras sondas fluorescentes.
Introduction
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son subproductos naturales del metabolismo celular. También pueden ser producidos activamente por complejos enzimáticos especializados como las NADPH-Oxidasas (NOX) y las Oxidasas Duales (DUOX) unidas a la membrana, que generan anión superóxido y peróxido de hidrógeno1. Al expresar enzimas antioxidantes y eliminadores de ROS, las células pueden ajustar finamente su equilibrio redox, protegiendo así la homeostasis tisular2. Aunque las ROS pueden ser altamente tóxicas para las células y dañar el ADN, las proteínas y los lípidos, son moléculas de señalización cruciales2. En el epitelio intestinal, se requieren niveles moderados de ROS para la proliferación de células madre y progenitoras3; los niveles altos de ROS conducen a su apoptosis4. El estrés oxidativo crónico está relacionado con muchas enfermedades gastrointestinales, como las enfermedades inflamatorias intestinales o el cáncer. Como ejemplo, en un modelo de ratón de cáncer intestinal impulsado por Wnt, se encontró que la producción elevada de ROS a través de la activación de NADPH-oxidasas era necesaria para la hiperproliferación de las células cancerosas5,6. Definir cómo las células intestinales, en particular las células madre, las células madre gestionan el estrés oxidativo y cómo el entorno celular puede afectar a esta capacidad es esencial para comprender mejor la etiología de esta enfermedad7.
En un tejido, diferentes tipos de células presentan un estado oxidativo basal que puede variar según su función y metabolismo y la expresión de niveles variables de moléculas oxidantes y antioxidantes4,7. El monitoreo de ROS in vivo es muy desafiante. Se han desarrollado colorantes permeables a las células que emiten fluorescencia de acuerdo con su estado redox para visualizar y medir las ROS celulares en células vivas y animales. Sin embargo, su eficacia depende de su difusión en el interior de los tejidos vivos y de su rápida lectura, lo que dificulta su uso en modelos animales8.
En el pasado, el estudio del efecto de los compuestos en la generación de ROS se realizaba utilizando líneas celulares, pero esto puede no reflejar la situación in vivo . El modelo organoide intestinal, desarrollado por el grupo de Clevers9, permite el crecimiento de células primarias intestinales ex vivo. El cultivo de criptas intestinales en matrices, en presencia de factores de crecimiento definidos, conduce a estructuras tridimensionales, llamadas organoides (mini-intestino), que reproducen la organización cripta-vellosidad, con células de los diferentes linajes epiteliales que recubren una luz interna, y las células madre intestinales que residen en pequeñas protuberancias similares a criptas.
Aquí, aprovechando este modelo, se describe un método simple para estudiar el estrés oxidativo en células intestinales primarias a la resolución de una sola célula mediante la adición de un tinte sensible a ROS disponible comercialmente en el medio de cultivo de organoides.
Los lectores de placas se utilizan a menudo para detectar la producción de ROS en una población total. Este protocolo utiliza citometría de flujo o ensayo de imágenes para detectar ROS en un tipo de célula en particular con células modificadas genéticamente o tinción de anticuerpos específicos. Este trabajo involucra el cultivo de organoides intestinales de ratón y la visualización de ROS por imágenes confocales y la cuantificación por citometría de flujo. Utilizando organoides del intestino delgado derivados de ratones Lgr5-GFP, es posible analizar específicamente el nivel de estrés oxidativo en las células madre intestinales en diferentes tratamientos. Este protocolo se puede adaptar para probar la influencia de moléculas exógenas, como el muramilo-dipéptido derivado de la microbiota (MDP)10, en el equilibrio de las ROS, después de estimular los organoides con los compuestos seleccionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo proporciona un protocolo paso a paso para aislar criptas yeyunales murinas, cultivarlas en organoides 3D y analizar ROS en organoides mediante la combinación de una sonda fluorogénica sensible a ROS con imágenes de microscopía cualitativa de organoides completos y medición cuantitativa de ROS utilizando citometría de flujo en células individuales después de la disociación organoide.
El primer paso crítico en este método es el procedimiento de extracción de criptas. De …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la agencia nacional de investigación francesa (ANR) subvención 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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