Analyse af oxidativ stress i murintarmorganoider ved hjælp af reaktiv iltartsfølsom fluorogen sonde
Summary
Den foreliggende protokol beskriver en metode til påvisning af reaktive iltarter (ROS) i tarmmurineorganoiderne ved hjælp af kvalitativ billeddannelse og kvantitative cytometriassays. Dette arbejde kan potentielt udvides til andre fluorescerende sonder for at teste effekten af udvalgte forbindelser på ROS.
Abstract
Reaktive iltarter (ROS) spiller væsentlige roller i intestinal homeostase. ROS er naturlige biprodukter af cellemetabolisme. De produceres som reaktion på infektion eller skade på slimhindeniveau, da de er involveret i antimikrobielle reaktioner og sårheling. De er også kritiske sekundære budbringere, der regulerer flere veje, herunder cellevækst og differentiering. På den anden side fører overdrevne ROS-niveauer til oxidativ stress, som kan være skadelig for celler og favorisere tarmsygdomme som kronisk betændelse eller kræft. Dette arbejde giver en ligetil metode til at detektere ROS i tarmmurinorganoiderne ved levende billeddannelse og flowcytometri ved hjælp af en kommercielt tilgængelig fluorogen sonde. Her beskriver protokollen analysen af effekten af forbindelser, der modulerer redoxbalancen i tarmorganoider og detekterer ROS-niveauer i specifikke tarmcelletyper, her eksemplificeret ved analysen af tarmstamcellerne, der er genetisk mærket med GFP. Denne protokol kan anvendes sammen med andre fluorescerende sonder.
Introduction
Reaktive iltarter (ROS) er naturlige biprodukter af cellulær metabolisme. De kan også produceres aktivt af specialiserede enzymatiske komplekser såsom de membranbundne NADPH-oxidaser (NOX) og dualoxidaser (DUOX), som genererer superoxidaniion og hydrogenperoxid1. Ved at udtrykke antioxidantenzymer og ROS-ådselædere kan cellerne finjustere deres redoxbalance og derved beskytte vævets homeostase2. Selvom ROS kan være meget giftigt for cellerne og beskadige DNA, proteiner og lipider, er de afgørende signalmolekyler2. I tarmepitelet kræves moderate ROS-niveauer til spredning af stam- og stamceller3; høje ROS-niveauer fører til deres apoptose4. Kronisk oxidativ stress er forbundet med mange gastrointestinale sygdomme, såsom inflammatoriske tarmsygdomme eller kræft. Som et eksempel, i en musemodel af Wnt-drevet tarmkræft, blev forhøjet ROS-produktion gennem aktivering af NADPH-oxidaser fundet at være nødvendig for kræftceller hyperproliferation5,6. Det er vigtigt at definere, hvordan tarmceller, især stamceller, håndterer oxidativ stress, og hvordan det cellulære miljø kan påvirke denne kapacitet, for bedre at forstå ætiologien af denne sygdom7.
I et væv præsenterer forskellige celletyper en basal oxidativ tilstand, der kan variere afhængigt af deres funktion og metabolisme og ekspressionen af forskellige niveauer af oxidant- og antioxidantmolekyler4,7. Overvågning af ROS in vivo er meget udfordrende. Cellegennemtrængelige farvestoffer, der udsender fluorescens i henhold til deres redoxtilstand, er udviklet til at visualisere og måle cellulær ROS i levende celler og dyr. Deres effektivitet afhænger dog af deres diffusion inde i levende væv og deres hurtige udlæsning, hvilket gør dem vanskelige at bruge i dyremodeller8.
Tidligere blev undersøgelsen af virkningen af forbindelser på ROS-generering udført ved hjælp af cellelinjer, men dette afspejler muligvis ikke in vivo-situationen . Tarmorganoidmodellen, udviklet af gruppen Clevers9, muliggør vækst af intestinale primære celler ex vivo. Kultur af tarmkrypter i matricer, i nærvær af definerede vækstfaktorer, fører til tredimensionelle strukturer, kaldet organoider (mini-tarm), som reproducerer krypt-villus-organisationen, med celler fra de forskellige epitelafstamninger, der forer et indre lumen, og tarmstamcellerne, der er bosiddende i små kryptlignende fremspring.
Her beskrives en simpel metode til at studere oxidativ stress i primære tarmceller ved enkeltcelleopløsningen ved at tilføje et kommercielt tilgængeligt ROS-følsomt farvestof til organoidkulturmediet.
Pladelæsere bruges ofte til at detektere ROS-produktion i en samlet befolkning. Denne protokol bruger flowcytometri eller billeddannelsesassay til at detektere ROS i en bestemt celletype med genetisk modificerede celler eller specifik antistoffarvning. Dette arbejde involverer musetarmorganoidkultur og ROS-visualisering ved konfokal billeddannelse og kvantificering ved flowcytometri. Ved hjælp af Lgr5-GFP-mus-afledte tyndtarmsorganoider er det muligt specifikt at analysere niveauet af oxidativt stress i tarmstamceller ved forskellige behandlinger. Denne protokol kan tilpasses til at teste indflydelsen af eksogene molekyler, såsom mikrobiota-afledt muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balancen efter stimulering af organoider med de udvalgte forbindelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbejde giver en trinvis protokol til at isolere murine jejunal krypter, dyrke dem i 3D-organoider og analysere ROS i organoider ved at kombinere en ROS-følsom fluorogen sonde med kvalitativ mikroskopi billeddannelse af hele organoider og kvantitativ ROS-måling ved hjælp af flowcytometri på enkeltceller efter organoid dissociation.
Det første kritiske skridt i denne metode er krypter ekstraktion procedure. Faktisk er kvaliteten af kryptforberedelse nøglen til vellykket dannelse af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det franske nationale forskningsagenturs (ANR) bevilling 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
