Summary
空間距離は、別々の内皮細胞層と心筋細胞層の共培養モデルにおける低酸素/再酸素化傷害を評価する際の重要なパラメータであり、心筋細胞保護における内皮細胞の役割を試験するための好ましい in vitro モデルを提供するためには、共培養空間環境を最適化する必要があることを初めて示唆する。
Abstract
虚血性心疾患は、世界中の主要な死因および障害である。再灌流は虚血を超えてさらなる傷害を引き起こす。内皮細胞(EC)は、細胞間相互作用を介して心筋細胞(CM)を再灌流傷害から保護することができる。共培養は、細胞間相互作用の役割を調査するのに役立ちます。混合共培養は最も単純なアプローチですが、単一細胞型の単離処理および下流分析は実現不可能であるため、制限されています。ECがCM細胞損傷を用量依存的に減弱させることができるかどうか、およびこの保護が2つの細胞株間の接触距離を変えることによってさらに最適化され得るかどうかを調べるために、我々はマウス原発性冠状動脈内皮細胞および成体マウス心筋細胞を使用して、細胞間層間距離が0.5で変化した3種類の細胞培養インサートを試験した。 それぞれ1.0、および2.0mm。CMsのみでは、乳酸脱水素酵素(LDH)放出によって評価された細胞傷害は、低酸素状態の間、およびさらに再酸素化時に、距離が0.5および1.0mmと比較して2.0mmであったときに有意に増加した。ECとCMがほぼ直接接触していたとき(0.5mm)、低酸素症後のCMの再酸素化傷害の軽度の減衰しかなかった。この減衰は、空間距離が1.0mmのときに有意に増加した。2.0mmの距離では、ECは低酸素および低酸素/再酸素化の両方でCM傷害を減衰させ、ECがCMとクロストークするために十分な培養距離が必要であることを示し、分泌されたシグナル分子が循環し、保護経路を完全に刺激することができる。我々の知見は、EC/CM共培養空間環境を最適化することが、模擬虚血/再灌流傷害に対するCM保護におけるECの役割を試験するための好ましい in vitro モデルを提供するために必要であることを初めて示唆する。このレポートの目標は、研究者がこの重要なモデルを有利に活用するための段階的なアプローチを提供することです。
Introduction
虚血性心疾患は、世界中の死因および障害の主要な原因である1,2。しかし、再灌流の治療プロセスは、それ自体が心筋虚血/再灌流(IR)傷害として知られる心筋細胞死を引き起こす可能性があり、有効な治療法はまだない3。内皮細胞(EC)は、パラクリンシグナルの分泌、ならびに細胞間相互作用を通じて心筋細胞(CM)を保護することが示唆されている4。
細胞共培養モデルは、細胞機能および分化に対するオートクリンおよび/またはパラクリン細胞間相互作用の役割を調査するために広く使用されてきた。共培養モデルの中で、混合共培養が最も単純であり、2つの異なるタイプの細胞が所望の細胞比5で単一の培養区画内で直接接触している。しかし、細胞型間の別々の処理と単一の細胞型の下流分析は、混合集団を考えると容易には実現不可能である。
以前の研究では、低酸素および虚血性の侮辱が、乳酸脱水素酵素(LDH)の放出によって測定される細胞膜の完全性に重大な損傷を引き起こすことが示された。この傷害は、再酸素化時に悪化し、再灌流傷害を模倣する6、7、8。現在のプロトコルの目的は、ECの存在が低酸素および再酸素化(HR)によって引き起こされるCMの細胞膜漏出を用量依存的に減弱させることができ、ECの保護効果は2つの細胞株間の接触距離を変えることによって最適化できるという仮説を検証することであった。そこで、マウス初代冠動脈内皮細胞と成体マウス心筋細胞の3種類の細胞培養インサートを採用した。コーニング、メルクミリポア、グライナーバイオワンによってブランド化されたインサートは、細胞間ライン間距離がそれぞれ0.5、1.0、および2.0mmの3つの異なる細胞培養クロストーク条件を作成することができました。各ケースでインサートあたり100,000個のECがメッキされました。
さらに、このモデルにおいて、共培養中のECの密度がHR傷害減弱に寄与するかどうかを決定するために、我々は、EC濃度とCMによるLDH放出との間の用量反応関係を研究した。
このレポートは、研究者がこの重要なモデルを有利に利用するための段階的なアプローチを提供します。
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Protocol
1. 実験準備・めっき
- CM および EC は、製造元の指示に従って保守してください。
- 両方の細胞株がベンダーから到着したら解凍します。新鮮な培地で洗浄した後にT25フラスコにプレートする。各細胞培養培地は、細胞が購入したのと同じベンダーから購入することをお勧めします。翌日、培地で細胞をリフレッシュし、コンフルエントなときに使用します。
- 細胞培養インキュベーターを21%O2、5%CO2、74%N2で37°Cに維持し、加湿しておく。
注:このプロトコルで使用されるマウス初代冠状動脈内皮細胞はC57BL/6マウスの冠状動脈から単離され、成体マウス心筋細胞は成体C57BL/6Jマウス心臓から単離され、商業的に入手可能である( 材料表を参照)。
- CMを滅菌条件下で24ウェルプレートの底部(下層)にプレートする。24時間後、ECを共培養ウェルのインサート(または上位部分)にプレートする。ECめっきの24時間後、ECインサートをCMプレートベース上に置き、共培養期間を開始した。使用前に細胞を少なくとも12〜24時間共培養させる。これらの手順については、以下で詳しく説明します。
- CM細胞株コンフルエント性を光学顕微鏡下で推定する。細胞が培養フラスコ内で90%〜100%コンフルエントであるように見える場合、実験的なプレーティングを続行する。
- コンフルエントな細胞培養物を含むフラスコから培地を取り出し、T25フラスコ用に3〜5mLのトリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)でトリプシン処理する。フラスコを穏やかに攪拌し、37°Cで2〜5分間インキュベートし、次いで光学顕微鏡下で酵素進行を評価した。セルが切り上げられ始めたら、セルスクレーパーを使用してセルを表面から取り外します。
- 剥離後、T25フラスコ用の培地10mLを含む50mLチューブにトリプシン/細胞溶液を加えてトリプシン溶液を不活性化する。細胞懸濁液を120 x g で2分間遠心分離し、軟質細胞ペレットを得た。上清を除去し、ペレットを5mLの培地に再懸濁する。
- 細胞計数を行い、細胞生存率を確認するには、10 μLの再懸濁細胞と10 μLのトリパンブルー色素のアリコートを混合します。細胞カウンターを用いて生細胞を計数する。所望の播種密度を達成するために、新鮮な規則的な培地で細胞を希釈する。体積は、所望の種子密度およびストック溶液の細胞濃度に応じて計算される。すべてのめっきは無菌条件下で行う必要があります。
- 細胞外マトリックスで予めコーティングされた24ウェルプレートの底部に、1ウェルあたり300,000の密度のプレートCMを播種する。細胞を21%O2および5%CO2 で一晩37°Cに 維持する。
- 24時間後、ECをインサートあたり100,000の最適なプレーティング密度でインサートにプレートします(培養面積は33.6mm2です)(図1)。ECめっきの24時間後、ECインサートをCMウェル内に置き、共培養を開始する。実験を行う前に、細胞を12〜24時間共培養する。
- 実験が実行されるまでに、CM と EC の両方が 80% ~ 90% のコンフルエントに達していることを確認します。
2. 虚血/再灌流傷害をインビトロでシミュレートするための低酸素/再酸素化
メモ: 次の手順は説明どおりに実行する必要があります。その間に一時停止しないでください。
- 50 mLの円錐管に約25 mLの培地を注ぐことによって低酸素培地を調製する。上部をシリコーン膜でエアシールし、滅菌ピペットを使用して穴を開けます。別の穴を作り、今度はピペットをメディアに約2/3沈めたままにします。
- 培地を低酸素ガス(0.0125% O2、5%CO2、94.99% N2)で30 L/minの流量で5分間洗い流します。これにより、低酸素状態の開始時に媒体中に溶解するO2が最小限に抑えられます(ステップ2.5)。
- 付着細胞を含む24穴プレートまたは培養インサートの培地を捨て、100 μL/ウェルの10%リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で非常に穏やかに洗浄する。その後、新たに調製した低酸素培地500μLをプレートまたはインサートの各ウェルに加える。
注: このステップでは、培地中の低酸素症ができるだけ短時間中断され、その後、ステップ 2.5 で細胞およびメディアの真の低酸素状態が開始されます。- 正常酸素対照群では、元の培地をグルコースおよび血清を含む新鮮な正常培地と交換する。
- チャンバー内に滅菌水で満たされたペトリ皿を置くことによって低酸素チャンバーを加湿する。次に、低酸素基を含むプレートをチャンバー内に配置します。
- 低酸素チャンバーを低酸素ガス(0.0125%O2、5%CO2、94.99%N2)で30L/minの流量で5分間フラッシュします。チャンバーを37°Cのインキュベーター内に24時間置く。
- 低酸素状態の後、通常の条件下でCMおよびECを栽培する。これを行うには、プレート/インサートの古い培地を捨て、通常の培地(グルコースと血清を含む;各ウェル/インサートの500μLを含む)と交換し、通常の培養条件(21%O2、5%CO2、74%N2、37°C)下でインキュベーターに2時間保存して再灌流を模倣する。
- 培地置換の任意の効果について制御するために、低酸素培地が変化すると同時に正常酸素細胞の培地を変更する。
メモ: 図 2 に、このプロトコルの概略概要を示します。
3. エンドポイント評価
- 細胞培養培地を24ウェルプレートから96ウェルプレートに移す。24ウェルプレートの各ウェルから200μLの培地を使用し、それに応じて96ウェルプレートの4ウェルに均等に分配する。正常酸素症対低酸素症対HRのためにそれぞれ1つのプレートを使用してください。
- 細胞傷害の程度は、例えば、製造業者の指示に従って細胞傷害性アッセイキットを用いてLDHの吸光度を測定することによって決定する。アッセイプロトコールで指示されたように96ウェルプレートでアッセイを行う。
4. 統計
- パラメトリック データを平均/標準偏差として表示し、ノンパラメトリック データを中央値/四分位範囲を持つ箱ひげ図として表示します。タイプ1エラーの可能性を減らすために、許容可能なポストホック検定を使用した適切なパラメトリック検定と非パラメトリック多重比較検定を実行する必要があります。有意性は通常、アルファ 0.05 (両側) に設定されます。
- 現在の研究で実施されたすべての実験について、1回の実験内で少なくとも3つのウェル反復を実行します。統計分析に使用した各実験の繰り返しは3~6回であった。
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Representative Results
この実験で使用した3種類のインサート(A、B、C)はすべて、同じ孔径0.4μmです。両者の唯一の違いは、挿入からベースまでの高さで、2つの共培養細胞層間の距離をそれぞれ0.5、1.0、2.0mmにすることができ(図3)、異なるベンダーからのものである(詳細については 材料表を参照)。
IR損傷をシミュレートするためにHRを受ける2つの細胞株の別々の層を有する in vitro 共培養モデルを確立するために、我々はECの有無にかかわらず共培養されたCMの細胞膜完全性を調べた。CM層より上のさまざまな距離に配置できるEC用の別のインサートを利用することで、CMの膜損傷の重症度に対する細胞層距離の差異効果も評価することができました。別の実験セットでは、ECの密度、したがってECとCMの比率を変化させました。さらに、シミュレートされた虚血とシミュレートされたIR損傷を区別するために、実験は、1)正常酸素症、2)低酸素のみ、および3)HRの条件下で行った。このモデルでは、24時間の低酸素状態を使用し、続いて2時間の再酸素化を使用しました。
可変距離
セル層間の距離 0.5 mm (挿入 A)
CMを単独で培養した場合、低酸素症は正常酸素症と比較してLDH放出を有意に増加させ、我々の以前の研究と一致した(図4A)6。しかし、LDHは、低酸素のみの群と比較して、2時間の再酸素化時にわずかにしか増加しなかった。ECとCMを0.5mmの距離で共培養した場合、低酸素のみによるLDH放出の増加は減衰せず、ECが保護効果を示さなかったことを示している(低酸素のみの条件下でのCM単独群と比較して)。しかし、ECは人事中にCMに軽度だが重要な保護を行使した。
セル層間の距離 1.0 mm (B を挿入)
2つの細胞層間の距離を1.0mmに増加させたことを除いて、上記と同じ実験を行った(図4B)。我々は、LDH放出が低酸素のみによってCMsのみにおいても有意に増加することを見出した。しかし、0.5mmインサートとは異なり、CMのみのLDH増加は、低酸素のみに対するHRによって増強された。さらに、この増強は、CMのみの群と比較して、再酸素化中のECの存在によってより阻害され、ほぼ消失した。
セル層間の距離 2.0 mm (挿入 C)
2つの細胞株間に2.0mmの距離を作り出す共培養インサート(図4C)を使用した場合、低酸素時のCMのみによるLDH放出の有意な増加も、0.5mmおよび1.0mmの実験と同じ程度に見出された。しかし、興味深いことに、再酸素化によるLDH放出のさらなる増加は、1.0mm実験よりもさらに顕著であった。これらの増加の両方は、ECの存在によって減衰されたが、廃止されなかったが、ECは、0.5または1.0mmのインサートを使用することとは異なり、低酸素のみおよびHRの両方の条件下でCMを傷害から有意に保護したことを示している。
可変EC強度
異なる実験セットにおいて、2.0mmインサートに播種されたECの濃度を、インサート当たりそれぞれ25,000、50,000および100,000細胞に滴定した。LDH放出は、24時間低酸素化に続いて2時間再酸素化後に測定した。我々の結果は、共培養におけるEC強度の増加が、HRによって引き起こされるLDH放出の用量依存的減衰をもたらしたことを示した(図5)。正常酸素条件下ではそのような効果は見られなかった。
図1:ウェル内のインサートの概略図ECs(インサートあたり最大100,000細胞)を備えたインサートは、CM(ウェルあたり300,000個)を底部に取り付けた24ウェルプレートに移されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:実験計画 細胞は通常の酸素条件(21%O2)下で培養され、次いで2つの群に分割される:正常酸素対照群は、通常の条件下でさらに24時間培養され続けるが、低酸素群は、0.01%O2のみでグルコースを含まない低酸素チャンバー内で24 時間培養される。これらの24時間の介入の後、両方の細胞群を培地でリフレッシュし、21%O2 環境で再酸素化段階である別の2時間連続培養してから、最終的にエンドポイントアッセイ(LDH分析など)を実施します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:3つの異なるインサートの画像と回路図 インサート内の内皮細胞とウェルの底部の心筋細胞との間の距離は、異なるインサートを使用することによって変化させることができる。ここで使用される3種類のインサートはいずれも、同じ孔径0.4μmです。それらの間の唯一の違いは、挿入からベースまでの高さであり、これにより、2つの共培養細胞層間の距離をそれぞれ0.5(A)、1.0(B)、および2.0mm(C)にすることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:心筋細胞単独(CM;白)、内皮細胞単独(EC;黒)、およびCMとECとの共培養(チェックパターン)について、正常酸素(左)、低酸素のみ(中央)、低酸素/再酸素化条件(右)下での乳酸脱水素酵素(LDH;吸光度単位[au])の放出を評価する際の3種類の培養インサートの比較。 (c)2つの異なる細胞層間の距離が2.0mmである。ECsはインサート当たり100,000細胞の密度で播種し、CMは1ウェル当たり300,000細胞の密度で播種した。データは標準偏差±平均であり、1群あたりn=4である。統計: ANOVAに続いて、スチューデント-ニューマン-キュールズのポストホックテストが続きます。P < 0.05 (両側) は、比較された各ペア間の水平バーで示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:乳酸脱水素酵素(LDH;吸光度単位[au])の放出によって証明されるように、共培養内皮細胞の濃度(EC;25:25,000細胞/インサート;50:50,000細胞/インサートあたり;100:100,000細胞/インサートあたり100,000細胞)の用量依存的影響保護(右)と比較して、低酸素/再酸素化傷害に対する心筋細胞(CM)の保護(右)。ECは正常酸素条件下でのLDH放出に影響を及ぼさなかった。データは標準偏差±平均であり、1群あたりn=4である。統計: ANOVAに続いて、スチューデント-ニューマン-キュールズのポストホックテストが続きます。P < 0.05 (両側) は、比較された各ペア間の水平バーで示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルの重要なステップ
細胞共培養モデルは、心臓保護の細胞機構を研究するために使用されてきた。したがって、それらの間に意味のある距離を持つ2つの別々のレイヤーを作成する方法は、適切な共同文化モデルの開発にとって非常に重要です。シミュレートされたIR、すなわちHR、傷害を研究する際の課題は、虚血(低酸素症)自体だけでなく、再灌流(再酸素化)も細胞機能障害を悪化させることである。したがって、現実的なモデルは、例えば、低酸素単独ではなく、低酸素症後の再酸素化による傷害の十分に増加したことを実証することによって、これらの特性を反映する必要があるが、それでも細胞保護薬または我々の場合、ECの存在などの戦略による傷害の減衰を可能にする。興味深いことに、2つの細胞層間の距離は、適切な共培養モデルの開発において重要な役割を果たしているようである。ECとCMの間の距離が1.0mmと2.0mmであることを実証することができたが、さらに重要なことに、低酸素状態とHR状態の両方でECが存在することによって、わずか2.0mmのみが細胞傷害保護に一貫して好ましい結果をもたらした。
メソッドの変更とトラブルシューティング
共培養モデルにおける細胞間相互作用は、異なる共培養集団の数、細胞型の類似度、それらの間の物理的分離の程度、集団の局所環境の違い、培養量および共培養のタイミングの考慮などの複数の変数によって影響を受ける9、10、11、12.これらの要因の間にはトレードオフが存在します。これらの相互作用は環境の影響を強く受け、環境はプロトコルとセットアップによって決定されます。複製可能で、測定可能で、比較可能な実験モデルを開発することが重要です。我々のアプローチは、3つの異なる細胞培養インサートを除いて、2つの共培養細胞株の同じ比率、同じ体積の細胞培養培地およびアッセイ試薬などを使用して、正確な細胞数のプレーティングを通じて異なる時間に行われた異なる実験から得られたデータの一貫性を乱す可能性のある変数の数を制御および制限することでした。
方法の制限事項
私たちのモデルはECやCMでうまく機能しますが、これはおそらく心血管系におけるECの遍在的な存在によるものです。潜在的に関心のある他のタイプの細胞株が、CM、ニューロン、または インビトロで 研究される他の関心のある細胞とどの程度うまく相互作用するかは、異なる細胞株が共培養環境において異なる方法で相互作用する可能性があるため、まだ評価されていない。共培養細胞集団間の1つの違いは、例えば、それらが自然な競争相手または協力者であるかどうか、それらの生態学的関係であり得る。また、他のすべてのインビ トロ 細胞モデルと同様に、実験で生成された細胞損傷は、 インビボでの傷害の実際の病態生理学的状態を表していない可能性がある。さらに、ECとCMの間の試験距離が0.5、1.0、2.0mmであっても、 生体内での間隔を再現しないことを認める。所与の インビトロ モデルについて;しかし、我々の結果は、この技術を利用したい科学者によって研究される2つの細胞層間の最適な距離の意味を記述している。
既存/代替方法に対する本手法の意義
既存/代替の共培養方法には、細胞株の直接混合、またはトランスウェルプレート13、マイクロ流体プラットフォーム14または三次元足場15の使用などの分離度を有する分離環境の作成が含まれ、その中でトランスウェルプレートは最も安価で入手が容易である。自然な限界にもかかわらず、共培養は、より代表的なin vivo様組織モデルを提供し、ハイスループット試験および細胞間相互作用に対する薬物効果の詳細なモニタリングを可能にするため、薬物研究に非常に関連している16。我々のモデルは、2つの異なるタイプの細胞の完全で制御不能な混合物の代わりに、ECとCMの間の明確に定義された空間距離を使用して正確に較正された。さらに、このモデルでは、インビボでは言うまでもなく、混合共培養では達成できない個々のタイプの細胞を別々の処理および分析することができます。IR損傷は別々のHRプロセスを伴うため、このモデルは虚血/低酸素症と再灌流/再酸素化損傷の細胞メカニズムを別々に研究するのによく適している。我々のデータは、それがシミュレートされたIR傷害研究に使用される非常に貴重で効率的な細胞共培養モデルであるかもしれないことを示唆している。我々の観察は、ECがこの特定の共培養モデルにおいてCMとクロストークするために最適な空間距離(我々の場合は2.0mm)が必要であることを明らかに示しており、ECによって潜在的に分泌されたシグナル伝達分子が効果的に循環して、低酸素のみおよび/またはHRによる傷害に対するCMの違法な保護。
特定の研究分野における方法の重要性と潜在的な応用
我々のモデルは、マウス冠状動脈ECとマウスCMを組み合わせて、HR損傷に対する保護措置の調査を改善することの重要性を示している。共培養の空間的距離を変えることは、HRによって引き起こされるCM傷害に対するECの保護作用に影響を及ぼす空間的条件をよりよく理解する効果的な方法を実証する。ECの密度またはEC-対CM比は、HR傷害に対する保護の程度と正の相関があること。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、部分的には、米国退役軍人省生物医学研究所R&Dサービス(I01 BX003482)とM.L.R.への機関資金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
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