इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + आनुवांशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतक (जीईसीआई) का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में तेज
Summary
इस प्रोक्टोल का उद्देश्य इन विट्रो और वीवो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग इन एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में एक विधि प्रदान करना है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + साइटोसोलिक सीए2 + बफरिंग, ऊर्जा चयापचय और सेलुलर सिग्नल ट्रांसडक्शन को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + की ओवरलोडिंग न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में न्यूरोडिजेनरेशन और एपोप्टिक सेल डेथ सहित विभिन्न रोग स्थितियों में योगदान देती है। यहां हम एस्ट्रो में और वीवो में एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग के लिए आणविक दृष्टिकोण को लक्षित करने वाले सेल-प्रकार विशिष्ट और माइटोकॉन्ड्रिया प्रस्तुत करते हैं। हमने डीएनए प्लाज्मिड्स एन्कोडिंग माइटोकॉन्ड्रिया-टार्गेटिंग जेनेटिकली एन्कोडेड सीए2 + संकेतक (जीईसीआई) GCaMP5G या GCaMP6s (GCaMP5G/6s) का निर्माण किया, जिसमें एस्ट्रोसाइट और न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटर gfaABC1D और CaMKII और mitochondria-targeting (mito-) के साथ । इन विट्रो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग के लिए, प्लाज्मिड को GCaMP5G/6s व्यक्त करने के लिए सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में संक्रमित किया गया था। वीवो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग में, एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर (एएवी) को एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया में GCaMP5G/6s व्यक्त करने के लिए तैयार किया गया था और माउस दिमाग में इंजेक्ट किया गया था। हमारा दृष्टिकोण एस्ट्रोसॉलिक और माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + सिग्नलिंग के साथ-साथ एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + गतिशीलता को छवि देने के लिए एक उपयोगी साधन प्रदान करता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया गतिशील उपकोशिकीय ऑर्गेनेल्स हैं और ऊर्जा उत्पादन के लिए सेल पावरहाउस के रूप में माने जाते हैं। दूसरी ओर, माइटोकॉन्ड्रिया स्थानीय या साइटोसोलिक सीए2 + उगता के जवाब में मैट्रिक्स के लिए सीए2 + ले जा सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को प्रभावित करता है, जिसमें मेटाबॉलिक प्रक्रियाएं शामिल हैं जैसे ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड (टीसीए) चक्र और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन में प्रतिक्रियाएं, और शारीरिक परिस्थितियों1,2,3,4 के तहत सीए2 +-संवेदनशीलप्रोटीन कोनियंत्रितकरता है। माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + ओवरलोडिंग भी कोशिका मृत्यु के लिए एक निर्धारक है, जिसमें विभिन्न मस्तिष्क विकारों में परिगलन और एपोप्टोसिस शामिल हैं5,6,7। यह माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्रों (एमपीटीपी) के उद्घाटन और कैस्पे कोफैक्टर की रिहाई का कारण बनता है, जो एपोप्टोटिक सेल डेथ शुरू करता है। इसलिए, सेलुलर फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी को बेहतर ढंग से समझने के लिए जीवित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + गतिशीलता और हैंडलिंग का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है।
माइटोकॉन्ड्रिया सीए2 + तेज और efflux के बीच एक संतुलन के माध्यम से मैट्रिक्स Ca2 + होमोस्टेसिस बनाए रखते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + यूनिपोर्टर्स (एमसीयू) द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जबकि माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + एफ्लक्स को ना +-सीए2 +-ली+ एक्सचेंजर्स (एनसीएलएक्स) और एच +/Ca2 + एक्सचेंजर्स (mHCXs)8द्वारा मध्यस्थता की जाती है। जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) 9 की उत्तेजना के माध्यम से संतुलन को बेफिक्र किया जासकताहै । माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + होमोसटासिस भी अघुलनशील xCa2 +-xPO 4 x-xOH परिसरों 8 केगठनसे माइटोकॉन्ड्रियल बफरिंग से प्रभावित है ।
सीए 2 + एकाग्रता ([सीए2 + +]) में इंट्रासेलुलर और माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तनों का मूल्यांकन फ्लोरोसेंट या ल्यूमिनेसेंट सीए2 + संकेतकों द्वारा किया जा सकता है। Ca2 + संकेतकों के लिए बाध्यकारी स्पेक्ट्रल संशोधनों का कारण बनता है, जो जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में मुफ्त सेलुलर [सीए2 +] की रिकॉर्डिंग करने की अनुमति देता है। कोशिकाओं में सीए2 + परिवर्तनों की निगरानी के लिए वर्तमान में दो प्रकार की जांच उपलब्ध है: कार्बनिक रासायनिक संकेतक और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतक (जीईसीआई)। आम तौर पर, विभिन्न सीए2 + एफ़िनिटीज (केडीके आधार पर), स्पेक्ट्रल गुण (उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य), गतिशील पर्वतमाला, और संवेदनशीलता के साथ विभिन्न वेरिएंट जांच के तहत जैविक प्रश्नों के लिए उपलब्ध हैं। यद्यपि साइटोसोलिक सीए2 + इमेजिंग के लिए कई सिंथेटिक ऑर्गेनिक सीए2 + संकेतकों का उपयोग किया गया है, लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग के लिए माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में केवल कुछ ही चुनिंदा रूप से लोड किए जा सकते हैं, जिसमें रोड-2 सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है (समीक्षा के लिए10,11देखें)। हालांकि, रोड-2 में लंबे समय तक चलने वाले प्रयोगों के दौरान रिसाव की एक बड़ी खामी है; इसके अलावा, इसे माइटोकॉन्ड्रिया, अन्य ऑर्गेनेल्स और साइटोसोल के बीच विभाजित किया जाता है, जिससे विभिन्न उपविभाग में पूर्ण माप मुश्किल हो जाता है। इसके विपरीत, सेल-प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों और उपकोशिकीय डिब्बे लक्ष्यीकरण दृश्यों का उपयोग करके, जीईसीआई को सेल-और कंपार्टमेंट-विशिष्ट सीए2 + इमेजिंग इन विट्रो या वीवो के लिए विभिन्न सेल प्रकारों और उपकोशिकीय डिब्बों में व्यक्त किया जा सकताहै। एकल तरंगदैर्ध्य फ्लोरेसेंस तीव्रता आधारित जीसीएएमपी सीए2 + संकेतक हाल ही में प्रमुख जीईसीआई12, 13, 14,15,16के रूप में उभरे हैं। इस लेख में, हम एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में GCaMP5G और GCaMP5G/6s की माइटोकॉन्ड्रिया-टार्गेटिंग और सेल-प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इन सेल प्रकारों में तेज करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया में GCaMP6G/6s की अभिव्यक्ति का पता चला जा सकता है, और एकल माइटोकॉन्ड्रियल रिज़ॉल्यूशन में सीए2 + तेज को एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स इन विट्रो और वीवो मेंप्राप्त किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में, हम एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + सिग्नल के लिए एक विधि और प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हमने GECI GCaMP5G/6s को व्यक्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-टारगेटिंग और सेल ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर्स एंड स्ट्रोक (एनआईएनएस) ग्रांट R01NS069726 और R01NS094539 द्वारा एसडी को समर्थन दिया गया था । हम ऑडियो रिकॉर्डिंग के लिए एरिका DeMers शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
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