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Neuroscience

पार्किंसंस रोग के 6-hydroxydopamine चूहा मॉडल

Published: October 27, 2021 doi: 10.3791/62923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

पार्किंसंस रोग की समझ को आगे बढ़ाने के लिए 6-hydroxydopamine (6-OHDA) मॉडल का उपयोग दशकों से किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं कि औसत दर्जे के फोरब्रेन बंडल में 6-ओएचडीए इंजेक्ट करके चूहे में एकतरफा निग्रोस्ट्रियाटल घावों को कैसे किया जाए, मोटर घाटे का आकलन करें, और चरण परीक्षण का उपयोग करके घावों की भविष्यवाणी करें।

Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) के मोटर लक्षण - ब्रैडीकिनेसिया, अकिनेसिया, और आराम से कंपन- सबस्टेंसिया निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा (एसएनसी) और डोपामिनर्जिक स्ट्रिएटल घाटे में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के न्यूरोडीजेनेरेशन के परिणाम हैं। पशु मॉडल का व्यापक रूप से प्रयोगशाला में मानव विकृति का अनुकरण करने के लिए उपयोग किया गया है। कृन्तक पीडी के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले पशु मॉडल हैं क्योंकि उनके हैंडलिंग और रखरखाव में आसानी होती है। इसके अलावा, पीडी के शरीर रचना विज्ञान और आणविक, सेलुलर और औषधीय तंत्र कृन्तकों और मनुष्यों में समान हैं। न्यूरोटॉक्सिन, 6-hydroxydopamine (6-OHDA) का जलसेक, चूहों के एक औसत दर्जे का अग्रमस्तिष्क बंडल (MFB) में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के गंभीर विनाश को पुन: पेश करता है और पीडी लक्षणों का अनुकरण करता है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि पीडी के चूहे के मॉडल में एमएफबी में 6-ओएचडीए के एकतरफा माइक्रोइंजेक्शन को कैसे किया जाए और 6-ओएचडीए द्वारा प्रेरित मोटर घाटे को दिखाया जाए और चरण परीक्षण के माध्यम से डोपामिनर्जिक घावों की भविष्यवाणी की गई। 6-OHDA contralateral forelimb के साथ किए गए चरणों की संख्या में महत्वपूर्ण हानि का कारण बनता है।

Introduction

पीडी की मुख्य न्यूरोपैथोलॉजिकल विशेषताएं डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के क्रोनिक प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेशन हैं, जो सब्सटेंसिया निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा (एसएनसी) में हैं और α-सिन्यूक्लिन प्रोटीन 1 युक्त लेवी निकायों की उपस्थिति हैं। जैसा कि एसएनसी डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स अपने अक्षतंतुओं को निग्रोस्ट्रियाटल मार्ग के माध्यम से स्ट्रिएटम में प्रोजेक्ट करते हैं, एसएनसी में न्यूरॉन्स के न्यूरोडीजेनेरेशन के परिणामस्वरूप स्ट्रिएटम 2 में डोपामिनर्जिक घाटे का परिणाम होता है। स्ट्रिएटम में डोपामाइन की अनुपस्थिति प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष मोटर नियंत्रण मार्गों की गतिविधियों में असंतुलन का कारण बनती है, जो पीडी के मुख्य मोटर लक्षणों के लिए जिम्मेदार है: अकिनेसिया (धीमी गति से आंदोलन), ब्रैडीकिनेसिया (आंदोलनों को शुरू करने में कठिनाई), मांसपेशियों की कठोरता, और आराम 3,4,5 पर कंपन।

चूंकि पीडी की शुरुआत में शामिल आणविक और शारीरिक तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आए हैं, वर्तमान में उपलब्ध प्रमुख उपचार फार्माकोथेरेपी, गहरी मस्तिष्क उत्तेजना 6,7, आनुवंशिक उपचार 8 और सेल प्रत्यारोपण 9 के माध्यम से मोटर लक्षणों को कम करना चाहते हैं। इसलिए, प्रीक्लिनिकल अनुसंधान पीडी की शुरुआत में शामिल तंत्र को स्पष्ट करने और पीडी 10 से प्रभावित न्यूरॉन्स के अध: पतन को रोकने या रोकने के लिए प्रारंभिक निदान और नए उपचारों के लिए नए तरीकों की खोज करने के लिए मौलिक है।

पशु मॉडल का व्यापक रूप से प्रयोगशाला में मानव विकृति का अनुकरण करने के लिए उपयोग किया गया है, जो चिकित्सा और विज्ञान की प्रगति में योगदान देता है11,12,13,14। हालांकि, इस बात पर जोर देना आवश्यक है कि पशु मॉडल का सही विकल्प अध्ययन की सफलता के लिए मौलिक है। इसलिए, पशु मॉडल को तीन मुख्य पहलुओं में मान्य किया जाना चाहिए: i) चेहरे की वैधता, जिसमें पशु मॉडल में मानव विकृति की विशेषताएं होनी चाहिए; ii) रचनात्मक वैधता, जिसमें पशु मॉडल का एक ठोस सैद्धांतिक आधार होना चाहिए; और iii) भविष्यवाणी वैधता, जिसमें पशु मॉडल को नैदानिक उपचार के समान तरीके से उपचार का जवाब देना चाहिए।

वर्तमान में, कई जानवरों को पीडी के लिए पशु मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। मुख्य समूहों में स्तनधारी शामिल हैं, जैसे कि कृन्तक, प्राइमेट्स, मिनीपिग्स, कुत्ते और बिल्लियों, और अन्य समूह जैसे ड्रोसोफिला और ज़ेबराफ़िश। कृन्तक पीडी के लिए सबसे क्लासिक पशु मॉडल हैं और हैंडलिंग और रखरखाव में आसानी के कारण सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, पीडी के शरीर रचना विज्ञान और आणविक, सेलुलर और औषधीय तंत्र कृन्तकों और मनुष्यों में समान हैं।

2019 में किन और सहयोगियों द्वारा प्रकाशित एक समीक्षा ने 2000 के दशक में पीडी के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रमुख पशु मॉडल तरीकों का विश्लेषण किया और पाया कि सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले पशु मॉडल में न्यूरोटॉक्सिन जैसे 6-हाइड्रॉक्सीडोपामाइन (6-ओएचडीए) और 1-मिथाइल-4-फिनाइल-1,2,3,6-टेट्राहाइड्रोपायरिडिन (एमपीटीपी) शामिल थे। दोनों न्यूरोटॉक्सिन निग्रोस्ट्रिएटल मार्ग में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल डिसगुलेशन का कारण बनते हैं, जिससे सेल मृत्यु 16 हो जाती है। एक अन्य व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले मॉडल में पीडी की शुरुआत में शामिल विशिष्ट जीनों में उत्परिवर्तन के माध्यम से आनुवंशिक हेरफेर शामिल है, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल डिसरेगुलेशन 17 होता है। न्यूरोटॉक्सिन मॉडल का उपयोग आमतौर पर चिकित्सीय का मूल्यांकन और तुलना करने के लिए किया जाता है, जबकि आनुवंशिक मॉडल का उपयोग निवारक उपचार और अज्ञातहेतुक पीडी 15 के विकास का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

न्यूरोटॉक्सिन एमपीटीपी को 1980 के दशक के मध्य में पार्किंसनिज़्म का कारण बनने के लिए खोजा गया था, जब सात रोगियों ने पदार्थ का उपयोग किया और गंभीर पीडी लक्षणों का प्रदर्शन किया। लक्षणों के अलावा, रोगियों ने एल-डीओपीए के साथ उपचार का जवाब दिया, जिसने शोधकर्ताओं को अणु को सीधे पीडी से जोड़ा। 1986 में मामला प्रकाशित होने के बाद, कई शोधकर्ताओं ने प्रीक्लिनिकल पीडी रिसर्च 18 में एमपीटीपी का उपयोग करना शुरू कर दिया। शोधकर्ताओं ने पाया है कि एक लिपोफिलिक अणु होने के नाते, एमपीटीपी रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को पार कर सकता है और एमपीपी + 19 में परिवर्तित हो सकता है। यह विषाक्त पदार्थ न्यूरॉन्स के अंदर जमा होता है और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला के जटिल 1 को नुकसान पहुंचाता है, जिससे डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 20 की मृत्यु हो जाती है।

6-OHDA न्यूरोटॉक्सिन मॉडल का उपयोग पहली बार 196821 में निग्रोस्ट्रिएटल मार्ग के मोनोमाइन न्यूरॉन्स के अध: पतन को प्रेरित करने के लिए किया गया था। 6-OHDA मॉडल का उपयोग आमतौर पर nigrostriatal pathway में neurodegeneration का कारण बनने के लिए किया जाता है क्योंकि यह एक डोपामाइन एनालॉग है और कैटेकोलामाइन युक्त कोशिकाओं के लिए विषाक्त है। 6-OHDA मस्तिष्क में प्रवेश करने के बाद, इसे डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (डीएटी) द्वारा लिया जा सकता है, जिससे निग्रोस्ट्रिएटल पाथवे 22 का पतन होता है। क्योंकि 6-OHDA BBB में प्रवेश नहीं करता है, इसे सीधे इंट्रासेरेब्रल स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन 23 के माध्यम से प्रशासित किया जाना चाहिए। एक noradrenaline reuptake अवरोधक अक्सर 6-OHDA microinjection के साथ संयुक्त किया जाता है ताकि noradrenergic फाइबर को संरक्षित किया जा सके और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 24 का अधिक चयनात्मक अध: पतन प्रदान किया जा सके।

डीएटी 6-ओएचडीए लेने के बाद, यह न्यूरॉन्स के साइटोसोल में जमा हो जाएगा, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन करेगा और सेल डेथ 15 के लिए अग्रणी होगा। 6-OHDA के तीन अलग-अलग घावों के मॉडल अक्सर उपयोग किए जाते हैं: i) SNc25,26 के लिए घाव; ii) striatum27,28 के लिए घावों; iii) MFB29,30 के लिए घावों. स्ट्रिएटम में होने वाले घावों के परिणामस्वरूप एसएनपीसी में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स का धीमा और प्रतिगामी अध: पतन होता है। इसके विपरीत, एसएनपीसी और एमएफबी में होने वाले घावों के परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स का तेजी से और कुल अध: पतन होता है, जिससे अधिक उन्नत पार्किंसन लक्षण होते हैं31।

6-OHDA के एकतरफा या द्विपक्षीय इंजेक्शन डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में न्यूरोडीजेनेरेशन का कारण बन सकते हैं। 6-ओएचडीए हमेशा न्यूरॉन्स को गंभीर नुकसान नहीं पहुंचाता है; कभी-कभी, इंजेक्शन के परिणामस्वरूप आंशिक क्षति होती है, जिसका उपयोग पीडी 32 के शुरुआती चरणों का अनुकरण करने के लिए भी किया जाता है। एकतरफा इंजेक्शन का उपयोग आमतौर पर मॉडल की जानवरों के मोटर घाटे का आकलन करने और एम्फ़ैटेमिन / एपोमॉर्फिन-प्रेरित रोटेशन और स्टेपिंग टेस्ट 29 जैसे परीक्षणों के माध्यम से सेल हानि की भविष्यवाणी करने की क्षमता के कारण किया जाता है। द्विपक्षीय इंजेक्शन का उपयोग स्थानिक स्मृति और मान्यता 33 का मूल्यांकन करने के लिए सबसे अधिक किया जाता है।

एम्फ़ैटेमिन / एपोमॉर्फिन-प्रेरित रोटेशन परीक्षण एक व्यवहार परीक्षण है जिसका उपयोग आमतौर पर निग्रोस्ट्रिएटल मार्ग में सेल हानि की भविष्यवाणी करने के लिए किया जाता है। इसे एक ऐसी प्रक्रिया के रूप में परिभाषित किया गया है जिसमें डोपामाइन एगोनिस्ट के बार-बार प्रशासन से 6-ओएचडीए-घाव वाले जानवरों में घूर्णी व्यवहार की गहनता होती है। घूर्णी व्यवहार में एम्फ़ैटेमिन-प्रेरित ipsilateral रोटेशन या apomorphine-प्रेरित contralateral turns को एकतरफा घाव वाले कृन्तकों में परिमाणित करना शामिल है। दवा-प्रेरित घूर्णी व्यवहार की आलोचना की गई है क्योंकि रोटेशन मनुष्यों में पीडी लक्षणों के अनुरूप नहीं है और सहिष्णुता, संवेदीकरण और "प्राइमिंग" जैसे चर से प्रभावित हो सकता है।

प्राइमिंग इन व्यवहार परीक्षणों में सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक है। कुछ मामलों की सूचना दी गई है जिसमें एल-डीओपीए की एक खुराक ने घूर्णी व्यवहार में विफलता का नेतृत्व किया। इसके अतिरिक्त, समानांतर उपयोग के लिए एम्फ़ैटेमिन-प्रेरित परीक्षण और एपोमॉर्फिन-प्रेरित परीक्षण के संयुक्त अनुप्रयोग से संबंधित एक और महत्वपूर्ण कारक यह है कि वे कार्रवाई के विभिन्न तंत्रों के कारण विभिन्न समापन बिंदुओं को मापते हैं, जो विभिन्न सिग्नलिंग तंत्रों और मार्गों की निष्क्रियता को दर्शाते हैं। इसके अलावा, एम्फ़ैटेमिन-प्रेरित परीक्षण 50-60% से ऊपर के निग्रोस्ट्रियाटल घावों को मापने के लिए अधिक सटीक है, जबकि एपोमॉर्फिन-प्रेरित परीक्षण 80% 37 से ऊपर के घावों के लिए अधिक सटीक है।

कदम परीक्षण एक व्यवहार परीक्षण के रूप में उभरा है जो डोपामिनर्जिक न्यूरॉन अध: पतन और चिकित्सीय प्रभावों से संबंधित घाटे को इंगित करता है। यह एक दवा प्रेरित प्रक्रिया के बिना डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में 6-OHDA घाव के कारण एकिनेसिया के विश्लेषण को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, परीक्षण अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और आमतौर पर 1995 के बाद से उपयोग किया जाता है, जब इसे पहली बार ओल्सन एट अल.35 द्वारा वर्णित किया गया था। 1999 में, चांग एट अल.38 ने भी 6-ओएचडीए के कारण अध: पतन के स्तर के साथ कदम परीक्षण में चूहों के प्रदर्शन का विश्लेषण और तुलना की और पाया कि जिन जानवरों ने चरण परीक्षण में खराब प्रदर्शन किया था, उनमें डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स का अधिक महत्वपूर्ण अध: पतन भी था।

कदम परीक्षण 6-OHDA-घाव वाले चूहों में गंभीर डोपामिनर्जिक निग्रोस्ट्रिएटल क्षति की भविष्यवाणी करने के लिए एक उत्कृष्ट तरीका है। साक्ष्य बताते हैं कि मोटर घाटे कदम परीक्षण के दौरान 6-OHDA जलसेक के contralateral forelimb में दिखाई देते हैं जब SNc में डोपामिनर्जिक हानि की डिग्री >90% 39 है। यह पेपर चूहों के एमएफबी में 6-ओएचडीए के एकतरफा जलसेक के लिए स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल, तरीकों और सामग्रियों का वर्णन करता है और कदम परीक्षण के माध्यम से विष के कारण डोपामिनर्जिक घावों की भविष्यवाणी कैसे करें।

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Protocol

जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं ने पशु प्रयोग के नियंत्रण के लिए राष्ट्रीय परिषद (CONCEA) और Arouca कानून (कानून 11.794/2008) के नैतिक सिद्धांतों का पालन किया और स्थानीय नैतिकता समिति (CEUA-FFCLRP / USP (18.5.35.59.5) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. दवाओं की तैयारी

  1. केटामाइन / Xylazine के साथ संज्ञाहरण
    नोट: उपयोग किए जाने वाले केटामाइन की खुराक 70 मिलीग्राम / किग्रा है, और xylazine की खुराक 10 मिलीग्राम / किग्रा है।
    1. केटामाइन 100 मिलीग्राम / एमएल समाधान और xylazine 20 मिलीग्राम / एमएल समाधान का उपयोग करके एनेस्थेटिक के 1 एमएल तैयार करने के लिए, केटामाइन समाधान के 0.35 मिलीलीटर, xylazine समाधान के 0.25 मिलीलीटर, और 0.9% बाँझ खारा समाधान के 0.4 मिलीलीटर को मिलाएं। एनेस्थेटिक समाधान को 2 एमएल / किग्रा की अंतिम मात्रा में प्रशासित करें।
      नोट: xylazine के साथ केटामाइन 60-80 मिनट के लिए बेहोश करने की क्रिया का उत्पादन कर सकते हैं। यदि जानवर में अभी भी सजगता है (उदाहरण के लिए, हिंद पैर पिचिंग और / या ब्लिंकिंग रिफ्लेक्स), व्यक्तिगत खुराक का एक अतिरिक्त 10% प्रशासित करें।
  2. इमिप्रामाइन
    नोट: उपयोग की जाने वाली इमिप्रामाइन की व्यक्तिगत खुराक 20 मिलीग्राम / किग्रा है।
    1. imipramine 20 मिलीग्राम / एमएल समाधान के 1 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, imipramine के 20 मिलीग्राम और 0.9% बाँझ खारा समाधान के 1 एमएल गठबंधन। 1 mL / kg की अंतिम मात्रा पर imipramine समाधान का प्रशासन।
  3. मेलोक्सिकैम
    नोट: meloxicam की व्यक्तिगत खुराक का उपयोग किया 1 मिलीग्राम / किग्रा है।
    1. मेलोक्सिकैम 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान के 1 एमएल तैयार करने के लिए, मेलोक्सिकैम के 0.05 मिलीलीटर 2% और 0.9% बाँझ खारा समाधान के 0.95 मिलीलीटर को मिलाएं। दो दिनों के लिए दिन में एक बार 1 एमएल / किग्रा की अंतिम मात्रा में मेलोक्सिकैम समाधान का प्रशासन करें।
  4. एस्कॉर्बिक एसिड 0.1%
    1. 0.1% एस्कॉर्बिक एसिड के 1 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, एस्कॉर्बिक एसिड के 1 मिलीग्राम और 0.9% बाँझ खारा समाधान के 1 मिलीलीटर को मिलाएं।
  5. 6-hydroxydopamine (6-OHDA)
    नोट: 6-OHDA एक न्यूरोटॉक्सिन है जिसका उपयोग मस्तिष्क में डोपामिनर्जिक और नॉरएड्रिनर्जिक न्यूरॉन्स को चुनिंदा रूप से नष्ट करने के लिए किया जाता है। आंखों, नाक और मुंह की त्वचा और श्लेष्म झिल्ली के साथ सीधे संपर्क से बचें। 6-OHDA को संभालते समय, डबल नाइट्रिल दस्ताने, लैब कोट, डिस्पोजेबल गाउन, आंखों की सुरक्षा और सर्जिकल मास्क या फेस शील्ड पहनें। विष की कुल जलसेक मात्रा 4 μL / पशु है, और व्यक्तिगत राशि 6-OHDA / जानवर के 10 μg है।
    1. 2.5 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर 6-ओएचडीए के 1 एमएल तैयार करने के लिए, 6-ओएचडीए के 2.5 मिलीग्राम और 0.9% नमकीन समाधान के 1 मिलीलीटर को 0.1% एस्कॉर्बिक एसिड (ऊपर वर्णित) युक्त मिलाएं।
      नोट: 6-OHDA प्रकाश-संवेदनशील है और उज्ज्वल प्रकाश के संपर्क में आने पर तेजी से degrades. इसे ठीक से संभाला जाना चाहिए और प्रकाश से संरक्षित वातावरण में संग्रहीत किया जाना चाहिए। यदि समाधान का रंग लाल है, तो इसे छोड़ दें।
  6. लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड (2%)
    1. जानवर के लिए स्थानीय आवेदन के लिए 2% lidocaine समाधान तैयार करें।
      नोट: अधिकतम खुराक है कि लागू किया जा सकता है 7 मिलीग्राम /
  7. पॉली-एंटीबायोटिक निलंबन
    नोट: स्ट्रेप्टोमाइसिन और पेनिसिलिन के साथ पॉली-एंटीबायोटिक निलंबन ( सामग्री की तालिका देखें) को डिल्यूएंट की पूरी मात्रा के साथ आवेदन के समय तैयार किया जाना चाहिए, जिसका एम्पुल पाउडर के साथ शीशी के साथ होता है।
    1. रबर स्टॉपर पर धातु डिस्क निकालें। अल्कोहल के साथ रबर स्टॉपर कीटाणुरहित करें।
    2. 23 जी की सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करते हुए, शीशी में डिलुएंट इंजेक्ट करें। सुई निकालें और जोर से शीशी हिला जब तक निलंबन पूरी तरह से homogenized है. शीशी में थोड़ी हवा इंजेक्ट करें और निलंबन की वांछित मात्रा को वापस ले लें।
    3. एक गहरी इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन का प्रशासन करें, यह सुनिश्चित करने के लिए दवा को इंजेक्ट करने से पहले प्लंजर को खींचें कि कोई रक्त वाहिका तक नहीं पहुंचा है।
      नोट: लागू करने के लिए निलंबन की अंतिम मात्रा 0.5 mL / kg है।

2. सामग्री की तैयारी

नोट:: हमेशा रसायनों को संभालते समय सामग्री सुरक्षा डेटा शीट के साथ प्रदान किए गए निर्देशों का पालन करें।

  1. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण
    1. सर्जरी करने के लिए उचित रोशनी के साथ एक स्थिर और साफ बेंच पर स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस रखें। 70% इथेनॉल के साथ उपकरण कीटाणुरहित करें।
    2. जाँचें कि क्या डिवाइस के कान और incisor सलाखों को सही ढंग से संरेखित किया गया है। एक थर्मल कंबल रखें जहां प्रक्रिया के दौरान गर्म रहने के लिए सर्जरी के दौरान जानवर को रखा जाएगा। एक सटीक रेक्टल जांच के साथ जानवर के तापमान की निगरानी करें।
      नोट: थर्मल कंबल 37.5 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए ताकि जानवर 37 डिग्री सेल्सियस शरीर के शरीर के तापमान को बनाए रखे।
  2. माइक्रोइनफ्यूजन प्रणाली
    1. एक हैमिल्टन सिरिंज (50 μL या वांछित के रूप में) को भरें (70-80%) एक मेडिकल-ग्रेड पॉलीथीन माइक्रोटयूबिंग और डबल आसुत पानी (ddH2O) के साथ एक सुई से जुड़ा हुआ है और सिस्टम के माध्यम से रिसाव के लिए जांच करें।
    2. सिस्टम के माध्यम से हवा खींचें ताकि एक एकल हवा का बुलबुला माइक्रोट्यूब में 6-OHDA समाधान से सिरिंज में ddH2O को अलग कर सके।
      नोट: यह प्रक्रिया 6-OHDA के साथ हैमिल्टन सिरिंज को दूषित करने से बचती है और एक ही प्रयोगात्मक दिन पर कई चूहों के उपयोग की अनुमति देती है।
    3. जलसेक पंप पर हैमिल्टन सिरिंज की स्थिति ताकि यह दृढ़ता से जुड़ा हुआ है और सिरिंज का प्लंजर फ्रेम के समानांतर है जो इसे धक्का देने के लिए आगे बढ़ेगा। जलसेक पंप को 0.5 μL / मिनट की गति पर सेट करें ताकि 6-OHDA के 4 μL का कुल आवेदन 8 मिनट तक रहता है। यह पुष्टि करके जलसेक प्रणाली का परीक्षण करें कि कोई रिसाव नहीं है और जलसेक पहले से निर्धारित समय और मात्रा के अनुसार होता है।
    4. स्टीरियोटैक्सिक बांह के अंत में उपकरण के लिए माइक्रोट्यूब से जुड़े जलसेक की सुई संलग्न करें और जांचें कि सुई सतह पर 180 ° कोण पर स्थित है। सुनिश्चित करें कि सुई सीधी है और मुड़ी हुई नहीं है।
      नोट:: सभी वर्णित कार्यविधियों की सावधानीपूर्वक जाँच करें क्योंकि यदि जलसेक सिस्टम में कोई भी आइटम ठीक से काम नहीं करता है, तो यह सर्जरी की सफलता को खतरे में डाल सकता है।
  3. टांका
    1. सर्जरी के बाद चीरा सीवन करने के लिए 3/8 सर्कल सुई के साथ एक बाँझ नायलॉन गैर-अवशोषित टांका का उपयोग करें।
  4. Posturgical पुनर्प्राप्ति साइट
    1. एक साफ और निष्फल आवास बॉक्स रखें जहां जानवरों को पूरी तरह से ठीक होने तक निगरानी की जा सकती है (स्पर्श और हेरफेर के लिए उत्तरदायी)। thermoregulation के लिए बॉक्स में एक थर्मल कंबल रखो।
      नोट: जैसा कि थर्मोरेगुलेशन महत्वपूर्ण है, यदि आवश्यक हो तो शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक पूरक गर्मी स्रोत शामिल करें।

3. सर्जिकल प्रक्रिया

नोट: इस प्रोटोकॉल में, वयस्क नर स्प्राग-डॉली चूहों (200-250 ग्राम) को तापमान (22 ± 2 डिग्री सेल्सियस), एयर एक्सचेंज (15-20 एक्सचेंजों / घंटे), और प्रकाश-अंधेरे चक्र (12 घंटे / 12 घंटे) की नियंत्रित परिस्थितियों में रखा गया था, जो भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 3 या 4 जानवरों के साथ बक्से में वर्गीकृत किया गया था।

  1. सर्जरी के बाद के दिनों में वजन में बदलाव की निगरानी के लिए जानवरों का वजन करें। प्रशासित की जाने वाली दवाओं की खुराक की गणना करें।
  2. सर्जरी से 30 मिनट पहले इमिप्रामाइन इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित करें (संज्ञाहरण के प्रशासन से पहले ~ 10-15 मिनट), 27 जी सुई और 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके।
    नोट: imipramine noradrenaline ट्रांसपोर्टर (NAT) को अवरुद्ध करेगा और noradrenergic न्यूरॉन्स द्वारा 6-OHDA अपटेक को रोक देगा, जिससे घाव डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 40 के लिए अधिक चयनात्मक हो जाएगा।
  3. imipramine के प्रशासन के 10-15 मिनट के बाद, एक 27 जी सुई और एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर intraperitoneal ketamine / xylazine संज्ञाहरण प्रशासन। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि जानवर पूरी तरह से संवेदनाहारी न हो जाए। सत्यापित करें कि जानवर गहरे संज्ञाहरण के तहत है जब जानवर हिंद पैर पिंचिंग का जवाब नहीं देता है और एक पलक पलटा नहीं दिखाता है।
  4. चूहे के फर को सिर के क्षेत्र में शेव करें जहां चीरा होगा।
  5. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में चूहे की स्थिति।
    1. सिर को कृन्तक पट्टी पर रखें और इंटरएरल लाइन के नीचे बार को 3.3 मिमी ठीक करें।
    2. कान सलाखों की स्थिति, एक समय में एक तरफ. कृन्तक पट्टी और कान की सलाखों को रखें ताकि खोपड़ी का शीर्ष सीधे और सतह के समानांतर हो।
    3. नाक क्लैंप को समायोजित करें और परीक्षण करें कि सिर फर्म है और किसी भी तरफ नहीं जाता है।
  6. कॉर्निया को सूखने से रोकने के लिए चूहे की आंखों पर बाँझ नेत्र मरहम लागू करें।
  7. साइट कीटाणुरहित करने के लिए incised किया जा करने के लिए क्षेत्र के लिए povidone-आयोडीन लागू होते हैं।
  8. चीरा क्षेत्र के एनाल्जेसिया के लिए स्थानीय लिडोकेन लागू करें; 7 मिलीग्राम / किलोग्राम से अधिक नहीं है।
  9. एक 27 जी सुई और एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर meloxicam चमड़े के नीचे प्रशासित.
    नोट: Meloxicam एक nonsteroidal विरोधी भड़काऊ एनाल्जेसिक है कि मदद मिलेगी पशु सर्जरी के बाद ठीक हो जाएगा.
  10. पॉली-एंटीबायोटिक निलंबन इंट्रामस्क्युलर रूप से एक 23 जी सुई और एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके प्रशासित करें।
    नोट: पॉली-एंटीबायोटिक निलंबन को सर्जरी के बाद की वसूली में संभावित जीवाणु संक्रमण से बचने के लिए एक रोगनिरोधी उपचार के रूप में प्रशासित किया जाता है।
  11. जांचें कि जानवर चिमटी के साथ हिंद पंजे को चुटकी देकर ब्लिंक रिफ्लेक्सेस या हिंद अंग सजगता की जांच करके गहरी संज्ञाहरण की स्थिति में है।
  12. एक स्केलपेल के साथ, उस क्षेत्र में ~ 1.5 सेमी का चीरा बनाएं जहां माइक्रोइंजेक्शन होगा।
    नोट: बाँझ तकनीकों घाव बंद होने तक इस बिंदु से लागू कर रहे हैं।
  13. कपास swabs और कपास कलियों के साथ खोपड़ी क्षेत्र को साफ करें जब तक कि Bregma और Lambda देखा जा सकता है. Bregma और लैम्ब्डा को एक निष्फल ठीक कलम के साथ चिह्नित करें।
  14. जांचें कि ब्रेग्मा और लैम्ब्डा के पृष्ठीय-वेंट्रल (डीवी) निर्देशांक समान हैं। यदि वे अलग हैं, तो स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में चूहे को रीडजस्ट करें क्योंकि चूहे का सिर सही ढंग से स्थित नहीं है।
  15. Bregma के anteroposterior (AP) और mediolateral (ML) निर्देशांक को नोट करें।
  16. 41 के अनुसार सही MFB के AP और ML निर्देशांक पर जाएँ: AP: -4.3 मिमी, ML: Bregma से 1.6 मिमी।
  17. एक निष्फल ठीक कलम के साथ trepanation के क्षेत्र को चिह्नित करें।
  18. एक निष्फल ड्रिल के साथ, धीरे-धीरे जानवर की खोपड़ी को छेदते हैं, ध्यान रखते हुए ड्यूरा मेटर को घायल न करें।
  19. ड्यूरा मेटर पर माइक्रोइंजेक्शन सुई की स्थिति और डीवी निर्देशांक पर ध्यान दें। एक पतली सुई ले लो और धीरे से dura मेटर टूट. MFB के DV निर्देशांक (8.3 मिमी वेंट्रल) में सुई डालें, जहां माइक्रोइंजेक्शन होगा।
  20. MFB में 6-OHDA समाधान जारी करने के लिए microinjection पंप संचालित करें। जब माइक्रोइंजेक्शन समाप्त हो जाता है, तो यह देखने के लिए हैमिल्टन सिरिंज की जांच करें कि क्या 6-OHDA के 4 μL को इंजेक्ट किया गया है।
    नोट: microinjection पिछले 8 मिनट चाहिए.
  21. 6-OHDA के प्रशासन के बाद, दवा के बैकफ्लो से बचने के लिए सुई को हटाने से पहले 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें। जानवर के मस्तिष्क से धीरे-धीरे माइक्रोइंजेक्शन सुई को हटा दें।
  22. पोविडोन-आयोडीन के साथ चीरा क्षेत्र को फिर से कीटाणुरहित करें।
  23. ~ 3-4 सर्जिकल समुद्री मील के साथ चीरा क्षेत्र सीवन.
    नोट: गाँठ बहुत मजबूत या बहुत ढीला नहीं होना चाहिए।
  24. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से चूहे को हटा दें और इसे थर्मल कंबल पर वसूली के लिए एक साफ बॉक्स में रखें जब तक कि जानवर पूरी तरह से संज्ञाहरण से ठीक नहीं हो जाता है। हर 15 मिनट में जानवर का निरीक्षण करें जब तक कि यह संज्ञाहरण से पूरी तरह से जाग न जाए।

4. पश्चात की प्रक्रियाओं

  1. सर्जरी के बाद अगले चार दिनों में जानवरों के वजन की निगरानी करें। सर्जरी के बाद दो दिनों के लिए दिन में एक बार मेलोक्सिकैम चमड़े के नीचे के साथ उनका इलाज करें, प्रत्येक दिन के वजन के लिए खुराक को समायोजित करें।
    नोट: सर्जरी के बाद तीसरे दिन एनाल्जेसिक की आवश्यकता के लिए सभी जानवरों का मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
  2. कम से कम चार दिनों के लिए दैनिक चीरों की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे संक्रमित नहीं हैं। गर्मी, सूजन, दर्द, निर्वहन और लालिमा की तलाश करें जब तक कि चीरों को ठीक न कर दें।
  3. जानवर के शरीर के वजन की निगरानी करके भूख और पानी की खपत की जांच करें। जानवरों को खाने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए गीला फ़ीड दें। सर्जरी के बाद कम से कम चार दिनों के लिए दैनिक सामान्य शरीर की स्थिति, दृष्टिकोण और गतिशीलता का निरीक्षण करें। सर्जरी के 7-10 दिनों के बाद टांके को हटा दें।
    नोट:: पशु euthanized किया जाना चाहिए यदि नैतिक प्रक्रियाओं में परिभाषित समापन बिंदु तक पहुँच गए हैं।

5. कदम परीक्षण

  1. प्रशिक्षण
    नोट: जानवरों को परीक्षण से पहले तीन दिनों के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार, प्रशिक्षण दिन में दो बार होना चाहिए, एक बार सुबह में और एक बार दोपहर में, या सत्रों के बीच कम से कम 2 घंटे के अंतराल के साथ। टाइमर का उपयोग करके समय को ट्रैक करें।
    1. दिन 1
      1. पहले सत्र में, चूहे को ~ 1-2 मिनट के लिए दस्ताने में पकड़कर चूहे को संभालें ताकि चूहे को हैंडलर / प्रयोगकर्ता के साथ खुद को परिचित करने की अनुमति मिल सके।
      2. दूसरे सत्र में, चूहे को 20 सेकंड के लिए पकड़ने और इसे 20 सेकंड के लिए प्रोटोकॉल टेबल पर रखने के बीच वैकल्पिक। चरण परीक्षण के लिए प्रयोगात्मक सेटअप के साथ चूहे को परिचित करने के लिए 3 मिनट के लिए इस प्रशिक्षण चरण को दोहराएं।
    2. दिन 2
      1. पहले सत्र में, चूहे के दोनों अग्रभाग को प्रोटोकॉल टेबल पर अपने पिछले पंजे को पकड़कर और एक हाथ से वापस रखें। चूहे को प्रोटोकॉल तालिका की सपाट सतह पर 45 डिग्री के कोण पर हेडफर्स्ट नीचे की ओर झुकाएं। मेज पर क्षैतिज रूप से अंत तक ले जाएं, जिससे चूहे को दोनों पंजों के साथ मेज पर कदम रखने की अनुमति मिलती है (4 सेकंड में 90 सेमी कवर करें)। चूहे को 10 सेकंड के लिए दस्ताने में रखें, जिससे यह आराम कर सके; 3 मिनट के लिए इस पैटर्न को दोहराएं।
      2. दूसरे सत्र में, प्रोटोकॉल टेबल पर चूहे के एक अग्रभाग को एक हाथ से दूसरे को वापस पकड़कर रखें और दूसरे हाथ से चूहे की पीठ और हिंद पंजे को पकड़ें (चरण 5.1.2.1 देखें)। 4 सेकंड में अंत से अंत तक मेज पर क्षैतिज रूप से स्थानांतरित करें, जिससे चूहे को अपने मुफ्त पंजे के साथ कदम उठाने की अनुमति मिलती है। चूहे को 10 सेकंड के लिए दस्ताने में रखें, जिससे इसे आराम करने की अनुमति मिलती है, और एक और फोरपाव के साथ दोहराते हैं, इसके बाद बाकी की अवधि होती है। इस पैटर्न को दोहराएं, दो फोरपाव्स के बीच बारी-बारी से, और 3 मिनट के लिए आराम करें।
      3. प्रत्येक 1 मिनट के लिए प्रशिक्षण चरण को 3 बार दोहराएं।
    3. दिन 3
      1. पहले सत्र में, एक forepaw के लिए चरण 5.1.2.2 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें। एक और forepaw के साथ दोहराएँ, आराम की अवधि के बाद. इस पैटर्न को दोहराएं, दो फोरपाव्स के बीच बारी-बारी से, और 3 मिनट के लिए आराम करें।
      2. दूसरे सत्र में, चरण 5.1.2.2 में वर्णित कार्यविधि का पालन करें।
  2. परीक्षा
    नोट: कदम परीक्षण सर्जरी से पहले किया जाता है, स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के 2 और 4 सप्ताह बाद, contralateral forelimb के akinesia और 6-OHDA के कारण संभावित चोट का मूल्यांकन करने के लिए।
    1. चूहे को सतह पर 45 डिग्री के कोण पर पकड़ो, अपने हिंद अंगों को स्थिर करें और मंच पर आराम करने के लिए केवल एक अग्रभाग की अनुमति दें, जैसा कि ऊपर बताया गया है, प्रशिक्षण के दिन 3 के लिए।
    2. चूहे को 4 सेकंड में 90 सेमी की दूरी पर आगे खींचें, जिसमें दाएं या बाएं पंजे को सतह पर आराम दिया जाए।
    3. नोट्स लें और प्रत्येक दिशा में प्रत्येक पंजे के साथ उठाए गए फोरहैंड-समायोजन चरणों की संख्या निर्धारित करें।

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Representative Results

डोपामिनर्जिक घाव मूल्यांकन
कदम परीक्षण घाव के लिए पूर्वकाल अंग contralateral के akinesia के मूल्यांकन और 6-OHDA जलसेक (चित्रा 1) द्वारा प्रेरित nigrostriatal मार्ग के एक संभावित घाव के साथ जानवरों के चयन को सक्षम बनाता है। contralateral forelimb stepping test presurgery और सर्जरी के बाद 2 सप्ताह और 4 सप्ताह के बाद के प्रदर्शन की तुलना से बातचीत का पता चला (F2,74 = 93.63; p < 0.0001; दो-तरफ़ा दोहराए जाने वाले उपाय ANOVA) समय (पूर्व, 2, और सर्जरी के बाद 4 सप्ताह) और उपचार (शाम-संचालित और 6-OHDA-घाव) के बीच। Bonferroni के पोस्ट-हॉक परीक्षण ने सर्जरी के बाद दूसरे और चौथे सप्ताह में शाम-संचालित जानवरों की तुलना में सही एमएफबी में 6-ओएचडीए प्राप्त करने वाले जानवरों में घाव के लिए contralateral चरणों की संख्या में महत्वपूर्ण कमी दिखाई (पी < 0.0001) (चित्रा 1)। परिणाम पिछले अध्ययनों के उन लोगों के अनुरूप थे35।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जब डोपामिनर्जिक घाव पूरा नहीं होता है, तो चरण परीक्षण के परिणाम इस अध्ययन में प्रस्तुत परिणामों की सफलता की डिग्री तक नहीं पहुंचेंगे। पहले प्रकाशित एक अध्ययन ने इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एक ही प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 6-OHDA के माइक्रोइंजेक्शन के लिए सर्जरी करने के बाद आंशिक डोपामिनर्जिक घाव वाले जानवरों के साथ टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज़ (टीएच) के चरण परीक्षण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन किया। चरण परीक्षण (4-8 चरणों) में आंशिक घाटे की उनकी खोज न्यूरॉन्स 39 के ~ 60% के आंशिक डोपामिनर्जिक घाव का परिणाम है।

Figure 1
चित्रा 1: सही MFB में 6-OHDA या वाहन के एकतरफा जलसेक के लिए contralateral कदम परीक्षण पूर्व और posturgery का आकलन। डेटा से पता चलता है कि 6-OHDA प्राप्त करने वाले जानवरों में सर्जरी के बाद दूसरे और चौथे सप्ताह में घाव के लिए पूर्वकाल के अग्र-अंग contralateral के साथ चरणों की संख्या में महत्वपूर्ण कमी आई थी (****** पी < 0.0001 बनाम शाम पोस्टसर्जरी; दो-तरफा दोहराए जाने वाले उपाय एनोवा, बोनफेरोनी पोस्ट-हॉक)। माध्य के मानक त्रुटि ± माध्य के रूप में व्यक्त किया गया डेटा। वाहन 0.9% लवणीय समाधान है जिसमें 0.1% एस्कॉर्बिक एसिड होता है। परिणाम शाम समूह में 14 जानवरों और 6-OHDA समूह में 25 जानवरों पर आधारित हैं। संक्षेप: P = presurgery. 2 = सर्जरी के दो सप्ताह बाद। सर्जरी के बाद 4 = चार सप्ताह; 6-OHDA = 6-hydroxydopamine; MFB = औसत दर्जे का अग्रमस्तिष्क बंडल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Ipsilateral forelimb stepping test presurgery और सर्जरी के बाद 2 सप्ताह और 4 सप्ताह के प्रदर्शन की तुलना ने किसी भी बातचीत को प्रकट नहीं किया (F2,74 = 0.4492; p = 0.6399; दो-तरफ़ा दोहराया-उपाय ANOVA) समय (पूर्व, 2, और सर्जरी के बाद 4 सप्ताह) और उपचार (शाम-संचालित और 6-OHDA-घाव) के बीच। बोनफेरोनी के पोस्ट-हॉक परीक्षण ने शाम जानवरों की तुलना में सही एमएफबी में 6-ओएचडीए प्राप्त करने वाले जानवरों में घाव के लिए ipsilateral चरणों की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया (चित्रा 2)।

Figure 2
चित्रा 2: सही MFB में 6-OHDA या वाहन के एकतरफा जलसेक के लिए ipsilateral कदम परीक्षण पूर्व और posturgery का आकलन। डेटा से पता चलता है कि 6-OHDA प्राप्त करने वाले जानवरों ने सर्जरी के बाद दूसरे और चौथे सप्ताह में घाव के लिए पूर्वकाल के अग्र-अंग ipsilateral के साथ चरणों की संख्या में काफी कमी नहीं की (पी > 0.05 बनाम शाम पोस्टसर्जरी; दो-तरफा दोहराए जाने वाले उपाय एनोवा, बोनफेरोनी पोस्ट-हॉक)। माध्य के मानक त्रुटि ± माध्य के रूप में व्यक्त किया गया डेटा। वाहन 0.9% लवणीय समाधान है जिसमें 0.1% एस्कॉर्बिक एसिड होता है। परिणाम शाम समूह में 14 जानवरों और 6-OHDA समूह में 25 जानवरों पर आधारित हैं। संक्षेप: P = presurgery. 2 = सर्जरी के दो सप्ताह बाद। सर्जरी के बाद 4 = चार सप्ताह; 6-OHDA = 6-hydroxydopamine; MFB = औसत दर्जे का अग्रमस्तिष्क बंडल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6-OHDA-घाव वाले जानवरों 42 पर पिछले अध्ययनों के अनुरूप, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 3) दोनों गोलार्धों के स्ट्रिएटम के टीएच की तुलना करने से स्ट्रिएटम में डीए घाटे का विश्वसनीय मूल्यांकन किया जा सकता है। इसलिए, इस व्यवहार प्रोटोकॉल का उपयोग पीडी के प्रयोगात्मक मॉडल से जुड़े अध्ययनों में इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधियों के साथ संयोजन में किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: पीडी के 6-ओएचडीए प्रयोगात्मक मॉडल में टीएच लेबलिंग की प्रतिनिधि छवियां, जिसमें पूर्वकाल स्ट्रिएटम और सब्सटेंसिया निग्रा कॉम्पैक्टा शामिल हैं। पैनोरमिक छवि घाव के विस्तार को दर्शाती है, और इनसेट ज़ूम इनर्वेशन ई सेल निकायों को दर्शाते हैं। (ए) दाएं गोलार्ध में 6-ओएचडीए द्वारा प्रेरित आंशिक चोट को दर्शाते हुए स्ट्रिएटल कोरोनल अनुभाग की छवि। (बी) एक ही जानवर से सब्सटेंशिया निग्रा और वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र कोरोनल सेक्शन की छवि भी घाव के विस्तार को दर्शाती है। (C) दाएं गोलार्ध में 6-OHDA द्वारा एक पूर्ण प्रेरित चोट दिखाते हुए स्ट्रिएटल कोरोनल अनुभाग की छवि। (घ) एक ही जानवर से सब्सटेंशिया निग्रा और वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र कोरोनल अनुभाग की छवि भी घाव के विस्तार को दर्शाती है। स्केल बार = 1.3 मिमी मनोरम दृश्य में और 65 μm इनसेट ज़ूम में। संक्षेप: 6-OHDA = 6-hydroxydopamine; TH = tyrosine hydroxylase; पीडी = पार्किंसंस रोग; एनएल = गैर-घाव; L = घाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह पेपर एमएफबी में 6-ओएचडीए के एकतरफा माइक्रोइनफ्यूजन के लिए सर्जरी करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो निग्रोस्ट्रियाटल मार्ग के न्यूरॉन्स में मजबूत घाव पैदा करने और जानवर में अकिनेसिया उत्पन्न करने में सक्षम है। इसके अलावा वर्णित कदम परीक्षण करने के लिए प्रोटोकॉल है, एक आसानी से लागू और noninvasive परीक्षण है कि घावों की सफलता को साबित करने और forelimb akinesia का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत किया गया है, 6-OHDA प्राप्त करने वाले जानवरों ने चोट के लिए contralateral को समायोजित करने वाले चरणों की संख्या में कमी दिखाई, जिसका अर्थ है कि 6-OHDA-घायल जानवर जलसेक सर्जरी के बाद 2 सप्ताह से मजबूत अकिनेसिया प्रदर्शित करते हैं। अकिनेसिया- बीमारी के लिए कई उपचारों का ध्यान केंद्रित करना- पीडी के मुख्य मोटर लक्षणों में से एक है। एक पशु मॉडल में अकिनेसिया का विकास पीडी के प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, ये परिणाम चांग एट अल.37 द्वारा रिपोर्ट किए गए लोगों से मिलते-जुलते हैं, जिन्होंने पुष्टि की कि कम संख्या में कदम पेश करने वाले जानवरों में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा डोपामिनर्जिक न्यूरॉन मृत्यु का उच्च प्रतिशत था। इसलिए, जिन जानवरों ने कम संख्या में contralateral समायोजन चरणों को प्रस्तुत किया, उनमें डोपामिनर्जिक चोट होने की अधिक संभावना है।

सर्जरी और घावों की सफलता का आकलन भी अन्य व्यवहार परीक्षणों जैसे एम्फ़ैटेमिन / एपोमॉर्फिन-प्रेरित रोटेशन 43, ऊंचा शरीर स्विंग टेस्ट (ईबीएसटी), कॉरिडोर टेस्ट, सिलेंडर परीक्षण, ऊतक लेबलिंग तकनीकों जैसे टीएच इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री, या यहां तक कि एचपीएलसी 42 द्वारा स्ट्रिएटम में डोपामाइन के परिमाणीकरण द्वारा भी पुष्टि की जा सकती है। अन्य तरीके 6-OHDA की इंजेक्ट की गई खुराक और व्यवहार मूल्यांकन के लिए सर्जरी के बाद के समय अंतराल में भिन्न होते हैं। एक हालिया समीक्षा 43 इस पद्धति का उपयोग करके सबसे हाल के लेखों और उनके बीच खुराक, व्यवहार परीक्षण और पोस्टसर्जरी अंतराल में अंतर को संक्षेप में प्रस्तुत करती है। 6-OHDA द्वारा प्रेरित पीडी का मॉडल बीमारी से संबंधित सभी रोग प्रक्रियाओं की नकल नहीं करता है, जैसे कि लेवी निकायों का संचय, लेकिन स्ट्रिएटल-निग्राल मार्ग के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की मृत्यु का अनुकरण करता है। यह रोग के लक्षणों के लिए नए उपचारों के अध्ययन को सक्षम बनाता है, जिससे इस बीमारी से प्रभावित रोगियों के जीवन की गुणवत्ता में सुधार हो सकता है।

सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले मॉडल होने के बावजूद, 6-OHDA मॉडल की सभी वर्तमान पीडी मॉडल की तरह अपनी सीमाएं हैं। मॉडल में बीमारी की विकृति में शामिल आणविक तंत्र का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करने का नुकसान है, जैसे कि अल्फा-सिन्यूक्लिन प्रोटीन का संचय और लेवी निकायों का गठन। मॉडल nigrostriatal मार्ग के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की मौत simulates, रोग के एक देर से चरण के लिए इसी और केवल मोटर लक्षणों की शुरुआत के लिए अग्रणी. यह इसे अपने प्राकृतिक विकास 15,32 का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त बनाता है। इस लेख में वर्णित 6-OHDA मॉडल आमतौर पर कम मृत्यु दर की विशेषता है। Posturgery वसूली एक आक्रामक प्रक्रिया और neurodegenerative घाव 44 के संघ के कारण उच्च मृत्यु दर को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। पोषण पूरकता, पुनर्जलीकरण और बाहरी तापमान नियंत्रण 45 के साथ पोस्टसर्जरी वसूली अवधि के दौरान अतिरिक्त देखभाल करके मृत्यु दर को कम करना संभव है। इस तरह के उपायों के संयोजन को मृत्यु दर को कम करने या यहां तक कि 30,46 को खत्म करने के लिए दिखाया गया है। मृत्यु का एक सामान्य कारण मस्तिष्क में गलत समन्वय पर सुई का सम्मिलन है। इस नाजुक सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान निर्देशांक की सावधानीपूर्वक जांच करना महत्वपूर्ण है। यह सुई द्वारा अन्य मस्तिष्क संरचनाओं (जैसे, हाइपोथैलेमस) को नुकसान से बचाएगा, जो जानवरों के खाने और पीने के कार्यों को खराब कर सकता है, जिससे कुपोषण और निर्जलीकरण हो सकता है।

अंत में, यह उजागर करना आवश्यक है कि हालांकि केटामाइन-ज़ाइलाज़िन संज्ञाहरण प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित है और कृंतक प्रयोगों में उपयोग किया जाता है, कुछ सबूत बताते हैं कि इन एनेस्थेटिक्स का संयोजन सर्जरी की विस्तारित अवधि के लिए अपर्याप्त हो सकता है। इसके अतिरिक्त, केटामाइन-xylazine संवेदनशीलता चूहों और चूहों के विभिन्न उपभेदों के अनुसार भिन्न हो सकती है49,50। एक विकल्प isoflurane साँस लेने के द्वारा संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए हो सकता है। एक अध्ययन ने केटामाइन-xylazine की तुलना में आइसोफ्लुरेन-प्रेरित संज्ञाहरण के साथ राइटिंग रिफ्लेक्स के तेजी से नुकसान का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, 60% चूहों ने केटामाइन-xylazine के साथ anesthetized सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान लगातार पैर की अंगुली चुटकी सजगता प्रस्तुत की, यहां तक कि खुराक पूरकता के साथ भी। इसके विपरीत, आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटिक जानवरों ने पूंछ पिंच रिफ्लेक्सेस के अलग-अलग मामलों को प्रस्तुत किया जो वॉल्यूम समायोजन 51 के बाद गायब हो गए।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (FAPESP, अनुदान 2017/ हम उच्च शिक्षा कर्मियों (CAPES) के सुधार के लिए समन्वय के लिए आभारी हैं। हम डॉ एंथनी आर वेस्ट, डॉ हेंज स्टेनर, और डॉ कुई वाई त्सेंग को समर्थन और सलाह देने के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OHDA Sigma Aldrich H4381 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel
_6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid Sigma Aldrich 795437 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid=
Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD
RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09
_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO
6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL Hamilton 80539 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine Alfa Aeser J63723 https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump Insight EFF-311 https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino) Ourofino https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic Zoetis https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus Insight EFF-331 https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 176
पार्किंसंस रोग के 6-hydroxydopamine चूहा मॉडल
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Guimarães, R. P., Ribeiro, D.… More

Guimarães, R. P., Ribeiro, D. L., dos Santos, K. B., Godoy, L. D., Corrêa, M. R., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62923, doi:10.3791/62923 (2021).

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