Direkte und indirekte Kulturmethoden zur Untersuchung biologisch abbaubarer Implantatmaterialien in vitro
Summary
Wir stellen drei Methoden der direkten Kultur, der direkten Expositionskultur und der Expositionskultur zur Bewertung der In-vitro-Zytokompatibilität von biologisch abbaubaren Implantatmaterialien vor. Diese In-vitro-Methoden ahmen verschiedene In-vivo-Zell-Implantat-Interaktionen nach und können zur Untersuchung verschiedener biologisch abbaubarer Materialien angewendet werden.
Abstract
In den letzten Jahrzehnten wurden biologisch abbaubare Materialien für biomedizinische Anwendungen wie orthopädische, zahnärztliche und kraniomaxillofaziale Implantate umfassend erforscht. Um biologisch abbaubare Materialien für biomedizinische Anwendungen zu screenen, ist es notwendig, diese Materialien in Bezug auf In-vitro-Zellreaktionen , Zytokompatibilität und Zytotoxizität zu bewerten. Die Standards der Internationalen Organisation für Normung (ISO) wurden bei der Bewertung von Biomaterialien häufig verwendet. Die meisten ISO-Normen wurden jedoch ursprünglich festgelegt, um die Zytotoxizität von nicht abbaubaren Materialien zu bewerten, wodurch ein begrenzter Wert für das Screening biologisch abbaubarer Materialien erbracht wurde.
Dieser Artikel stellt drei verschiedene Kulturmethoden vor und diskutiert sie, nämlich die direkte Kulturmethode, die direkte Expositionskulturmethode und die Expositionskulturmethode zur Bewertung der In-vitro-Zytokompatibilität von biologisch abbaubaren Implantatmaterialien, einschließlich biologisch abbaubarer Polymere, Keramiken, Metalle und ihrer Verbundwerkstoffe, mit verschiedenen Zelltypen. Die Forschung hat gezeigt, dass Kulturmethoden die Zellreaktionen auf biologisch abbaubare Materialien beeinflussen, da ihr dynamischer Abbau räumlich-zeitliche Unterschiede an der Grenzfläche und in der lokalen Umgebung induziert. Insbesondere zeigt die direkte Kulturmethode die Reaktionen von Zellen, die direkt auf den Implantaten ausgesät sind; die Methode der direkten Expositionskultur klärt die Reaktionen etablierter Wirtszellen auf, die mit den Implantaten in Kontakt kommen; Und die Expositionskulturmethode wertet die etablierten Wirtszellen aus, die nicht in direktem Kontakt mit den Implantaten stehen, sondern durch die Veränderungen in der lokalen Umgebung aufgrund des Implantatabbaus beeinflusst werden.
Dieser Artikel enthält Beispiele für diese drei Kulturmethoden zur Untersuchung der In-vitro-Zytokompatibilität von biologisch abbaubaren Implantatmaterialien und deren Wechselwirkungen mit aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen (BMSCs). Es beschreibt auch, wie man die Zellen erntet, durchlässt, kultiviert, samt, fixiert, färbt, charakterisiert und postkulturelle Medien und Materialien analysiert. Die in diesem Artikel beschriebenen In-vitro-Methoden ahmen verschiedene Szenarien der In-vivo-Umgebung nach und erweitern die Anwendbarkeit und Relevanz von In-vitro-Zytokompatibilitätstests verschiedener Biomaterialien für verschiedene biomedizinische Anwendungen.
Introduction
Seit Jahrzehnten werden biologisch abbaubare Materialien umfassend untersucht und in biomedizinischen Anwendungen wie orthopädischen1,2, dentalen3,4 und kraniomaxillofacialen5 Anwendungen eingesetzt. Im Gegensatz zu permanenten Implantaten und Materialien werden biologisch abbaubare Metalle, Keramiken, Polymere und ihre Verbundwerkstoffe im Laufe der Zeit durch verschiedene chemische Reaktionen in der physiologischen Umgebung allmählich im Körper abgebaut. Zum Beispiel sind biologisch abbaubare Metalle wie Magnesium (Mg) -Legierungen1,6,7 und Zink (Zn) –Legierungen8,9 vielversprechende Materialien für Knochenfixierungsgeräte. Ihre biologische Abbaubarkeit könnte die Notwendigkeit von Sekundäroperationen beseitigen, um die Implantate nach der Knochenheilung zu entfernen. Biologisch abbaubare Keramiken wie Calciumphosphatzemente (CPCs) haben ein aufregendes Potenzial für die Behandlung von osteoporotischen Wirbelkompressionsfrakturen in der perkutanen Kyphoplastie gezeigt10. Die CPCs unterstützen den gebrochenen Wirbelkörper mechanisch und bauen sich nach der Verheilung der Fraktur allmählich ab.
Biologisch abbaubare Polymere, wie einige Polysaccharide und Polyester, wurden auch für biomedizinische Anwendungen umfassend erforscht. Zum Beispiel hat Chitosan-Hydrogel als biologisch abbaubares Polysaccharid seine Fähigkeiten zur Vorbeugung von Infektionen und zur Regeneration von Hautgewebe unter Beweis gestellt11. Poly-L-Milchsäure (PLLA), Poly(glykolsäure) (PGA) und Poly(milch-Co-Glykolsäure) (PLGA) sind weithin untersuchte Polyester zur Herstellung von porösen 2D- oder 3D-Gerüsten für Tissue-Engineering-Anwendungen12,13,14. Darüber hinaus integrieren Verbundwerkstoffe zwei oder mehr Phasen von Metallen, Keramiken und Polymeren, um erweiterte Funktionen für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen bereitzustellen15,16,17. Beispielsweise können PLGA- und Calciumphosphat-Verbundwerkstoffe zur Herstellung biologisch abbaubarer Gerüste für Anwendungen wie die Reparatur von Schädelknochendefekten verwendet werden18. Diese biologisch abbaubaren Gerüste und Implantate könnten das Wachstum von Zellen und Geweben unterstützen und fördern und dann im Laufe der Zeit allmählich im Körper abgebaut werden.
Wie in der Ergänzenden Tabelle 1 gezeigt, können verschiedene biologisch abbaubare Materialien unterschiedliche Abbaumechanismen, Produkte und Raten aufweisen. Zum Beispiel werden Magnesiumlegierungen, wie Mg-2 Gew.-% Zn-0,5 Gew.-% Ca (ZC21)1, Mg-4 Gew.-% Zn-1 Gew.-% Sr (ZSr41)19 und Mg-9 Gew.-% Al-1 Gew.-% Zink (AZ91)20, durch Reaktion mit Wasser abgebaut, und ihre Abbauprodukte umfassen hauptsächlich Mg2+-Ionen, OH-Ionen, H2-Gas und Mineralablagerungen. Die Abbaurate für biologisch abbaubare Metalle variiert je nach ihrer unterschiedlichen Zusammensetzung, Geometrie und Abbauumgebung. Zum Beispiel berichteten Cipriano et al.19, dass ZSr41-Drähte (Ø1,1 × 15 mm) 85% Masse verloren, während reine Mg-Drähte mit der gleichen Geometrie 40% Masse verloren, nachdem sie 47 Tage lang in die Tibien der Ratte implantiert worden waren. Biologisch abbaubare keramische Materialien wie Hydroxylapatit (HA) und β-Tricalciumphosphat (β-TCP) können durch lösungsgetriebene extrazelluläre Flüssigkeitsauflösung abgebaut oder in kleine Partikel zerfallen und dann sowohl durch extrazelluläre Flüssigkeitsauflösung als auch durch zellvermittelte Resorptionsprozesse abgebaut werden. Die Abbauprodukte dieser Keramiken auf Calciumphosphatbasis können Ca2+-Ionen, (PO4)3-Ionen, OH-Ionen und Mineralablagerungen21 umfassen. Die Abbaurate für Calciumphosphatkeramiken wird maßgeblich durch ihre Kristallstrukturen beeinflusst. Zum Beispiel berichteten Van Blitterswijk et al.22, dass HA mit 40 Vol.% Mikroporen keine Masse verlor, während β-TCP mit 40 Vol.% Mikroporen 30 ± 4% Masse verlor, nachdem es 3 Monate lang in die Tibien von Kaninchen implantiert worden war. Polymere wie PLGA14,23 können aufgrund der Hydrolyse der Esterbindungen in Gegenwart von Wasser abgebaut werden, und die Abbauprodukte umfassen hauptsächlich Milch- und Glykolsäuren. Es kann einen Monat für PLGA 50/50 und mehrere Monate dauern, bis PLGA 95/5 eine vollständige Verschlechterung erreicht hat24.
Zellantwort- und Zytokompatibilitätstests sind entscheidend, um diese biologisch abbaubaren Implantatmaterialien für biomedizinische Anwendungen zu bewerten und zu screenen. Aktuelle Normen der Internationalen Organisation für Normung (ISO), wie ISO 10993-5:2009 “Biological evaluation of medical devices-Part 5 Tests for in vitro cytotoxicity”, wurden jedoch ursprünglich entwickelt, um die Zytotoxizität von nicht abbaubaren Biomaterialien wie Ti-Legierungen und Cr-Co-Legierungen in vitro25 zu bewerten. Insbesondere deckt ISO 10993-5:2009 nur die In-vitro-Zytotoxizitätstests des Extrakts, den direkten Kontakt und den indirekten Kontakt ab. Im Extrakttest wird der Extrakt durch Eintauchen von Proben in Extraktionsflüssigkeiten wie Kulturmedien mit Serum und physiologischen Kochsalzlösungen unter einer der üblichen Zeit- und Temperaturbedingungen hergestellt. Der gesammelte Extrakt oder die Verdünnung wird dann in die Zellkultur gegeben, um die Zytotoxizität zu untersuchen. Für den Direktkontakttest wird ein direkter Kontakt zwischen Probe und Zellen erreicht, indem die Testprobe auf die etablierte (haftete) Zellschicht gelegt wird. Beim indirekten Kontakttest werden die Kulturmedien, die Serum und geschmolzenes Agar enthalten, pipettiert, um die etablierten Zellen zu bedecken. Die Probe wird dann mit oder ohne Filter auf die erstarrte Agarschicht gelegt.
Die ISO-Normen haben einige Einschränkungen aufgezeigt, wenn sie zur Bewertung biologisch abbaubarer Materialien in vitro angewendet werden. Im Gegensatz zu nicht abbaubaren Materialien ist das Abbauverhalten von biologisch abbaubaren Materialien dynamisch und kann sich zu einem anderen Zeitpunkt oder unter verschiedenen Umgebungsbedingungen (z. B. Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Medienzusammensetzung und Zelltyp) ändern. Der Extrakttest bewertet nur die Zytotoxizität der Abbauprodukte des Materials und spiegelt nicht den dynamischen Prozess des Probenabbaus wider. Sowohl direkte als auch indirekte Kontakttests der ISO-Norm charakterisieren nur die Wechselwirkungen zwischen den etablierten Zellen und Proben. Darüber hinaus befinden sich die Materialien und Zellen beim indirekten Kontakttest in verschiedenen Mikroumgebungen, die die In-vivo-Umgebung nicht widerspiegeln und den dynamischen Abbau biologisch abbaubarer Materialien nicht erfassen.
Ziel dieses Artikels ist es, die Zytokompatibilitätstestmethoden für verschiedene biologisch abbaubare Implantatmaterialien vorzustellen und zu diskutieren, um die oben genannten Einschränkungen der in den aktuellen ISO-Normen beschriebenen Methoden zu beheben. Die in diesem Artikel vorgestellten Methoden berücksichtigen das dynamische Abbauverhalten von Implantatmaterialien und die unterschiedlichen Umstände von Zell-Material-Interaktionen in vivo. Insbesondere enthält dieser Artikel drei Zytokompatibilitätstestmethoden, nämlich Direktkultur, Direktexpositionskultur und Expositionskultur für verschiedene biologisch abbaubare Materialien, einschließlich biologisch abbaubarer Polymere, Keramik, Metalle und deren Verbundwerkstoffe für medizinische Implantatanwendungen.
Bei der direkten Kulturmethode werden in den Kulturmedien suspendierte Zellen direkt auf den Proben ausgesät und so die Wechselwirkungen zwischen neu ausgesäten Zellen und den Implantaten bewertet. In der direkten Expositionskultur werden die Proben direkt auf die etablierte Zellschicht gelegt, um die Wechselwirkungen von Implantaten mit etablierten Wirtszellen im Körper nachzuahmen. In der Expositionskultur werden die Proben in ihre jeweiligen Vertiefungseinsätze gegeben und dann mit etablierten Zellen in die Kulturvertiefungen eingeführt, was die Reaktionen etablierter Zellen auf die Veränderungen in der lokalen Umgebung charakterisiert, die durch den Implantatabbau induziert werden, wenn sie keinen direkten Kontakt mit Implantaten haben. Die Methoden der direkten Kultur und der direkten Expositionskultur bewerten die Zellen in Kontakt mit den Implantatmaterialien in derselben Kultur gut. Die Expositionskultur charakterisiert die Zellen indirekt in Kontakt mit den Implantatmaterialien innerhalb eines vorgeschriebenen Abstands in derselben Kultur gut.
Dieser Artikel enthält eine detaillierte Beschreibung der Zytokompatibilitätstests für verschiedene biologisch abbaubare Materialien und deren Wechselwirkungen mit Modellzellen, dh aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen (BMSCs). Die Protokolle umfassen die Ernte, Kultivierung, Aussaat, Fixierung, Färbung und Bildgebung der Zellen sowie Analysen von Postkulturmaterialien und -medien, die für eine Vielzahl von biologisch abbaubaren Implantatmaterialien und eine breite Palette von Zelltypen gelten. Diese Methoden sind nützlich für das Screening biologisch abbaubarer Materialien für verschiedene biomedizinische Anwendungen in Bezug auf Zellantworten und Zytokompatibilität in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschiedene Zellkulturmethoden können verwendet werden, um die In-vitro-Zytokompatibilität von Biomaterialien zu bewerten, die für verschiedene Aspekte von Anwendungen in vivo von Interesse sind. Dieser Artikel demonstriert drei In-vitro-Kulturmethoden, d.h. direkte Kultur, direkte Expositionskultur und Expositionskultur, um verschiedene In-vivo-Szenarien nachzuahmen, in denen biologisch abbaubare Implantatmaterialien im menschlichen Körper verwendet werden. Die direkte Kulturmeth…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren schätzen die finanzielle Unterstützung der U.S. National Science Foundation (NSF CBET Award 1512764 und NSF PIRE 1545852), der National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), der University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship und des Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) und des UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Die Autoren schätzen die Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) an der UC-Riverside für den Einsatz von SEM/EDS und Dr. Perry Cheung für den Einsatz von XRD-Instrumenten. Die Autoren schätzen auch Thanh Vy Nguyen und Queenie Xu für die teilweise Bearbeitung. Die Autoren möchten sich auch bei Cindy Lee für die Aufnahme der Erzählung für das Video bedanken. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Artikel zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation oder der National Institutes of Health wider.
Materials
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
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