Metodi di coltura diretta e indiretta per lo studio di materiali implantari biodegradabili in vitro
Summary
Introduciamo tre metodi di coltura diretta, coltura a esposizione diretta e coltura di esposizione per valutare la citocompatibilità in vitro di materiali implantari biodegradabili. Questi metodi in vitro imitano diverse interazioni cellula-impianto in vivo e possono essere applicati per studiare vari materiali biodegradabili.
Abstract
Negli ultimi decenni, i materiali biodegradabili sono stati ampiamente esplorati per applicazioni biomediche come impianti ortopedici, dentali e craniomaxillofacciali. Per lo screening di materiali biodegradabili per applicazioni biomediche, è necessario valutare questi materiali in termini di risposte cellulari in vitro , citocompatibilità e citotossicità. Gli standard dell’Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) sono stati ampiamente utilizzati nella valutazione dei biomateriali. Tuttavia, la maggior parte degli standard ISO sono stati originariamente stabiliti per valutare la citotossicità dei materiali non degradabili, fornendo così un valore limitato per lo screening dei materiali biodegradabili.
Questo articolo introduce e discute tre diversi metodi di coltura, vale a dire, metodo di coltura diretta, metodo di coltura di esposizione diretta e metodo di coltura di esposizione per valutare la citocompatibilità in vitro di materiali implantari biodegradabili, inclusi polimeri biodegradabili, ceramiche, metalli e loro compositi, con diversi tipi di cellule. La ricerca ha dimostrato che i metodi di coltura influenzano le risposte cellulari ai materiali biodegradabili perché la loro degradazione dinamica induce differenze spazio-temporali all’interfaccia e nell’ambiente locale. Nello specifico, il metodo di coltura diretta rivela le risposte delle cellule seminate direttamente sugli impianti; il metodo di coltura ad esposizione diretta chiarisce le risposte delle cellule ospiti stabilite che entrano in contatto con gli impianti; e il metodo di coltura di esposizione valuta le cellule ospiti stabilite che non sono in contatto diretto con gli impianti ma sono influenzate dai cambiamenti nell’ambiente locale dovuti alla degradazione dell’impianto.
Questo articolo fornisce esempi di questi tre metodi di coltura per studiare la citocompatibilità in vitro dei materiali implantari biodegradabili e le loro interazioni con le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BMSC). Descrive anche come raccogliere, passare, coltivare, seminare, fissare, macchiare, caratterizzare le cellule e analizzare i media e i materiali post-coltura. I metodi in vitro descritti in questo articolo imitano diversi scenari dell’ambiente in vivo , ampliando l’applicabilità e la rilevanza dei test di citocompatibilità in vitro di diversi biomateriali per varie applicazioni biomediche.
Introduction
Per decenni, i materiali biodegradabili sono stati ampiamente studiati e utilizzati in applicazioni biomediche come l’ortopedia1,2, dental3,4 e craniomaxillofacial5 applicazioni. A differenza degli impianti e dei materiali permanenti, i metalli biodegradabili, le ceramiche, i polimeri e i loro compositi si degradano gradualmente nel corpo nel tempo attraverso diverse reazioni chimiche nell’ambiente fisiologico. Ad esempio, i metalli biodegradabili come le leghe di magnesio (Mg)1,6,7 e le leghe di zinco (Zn)8,9 sono materiali promettenti per i dispositivi di fissazione ossea. La loro biodegradabilità potrebbe eliminare la necessità di interventi chirurgici secondari per rimuovere gli impianti dopo la guarigione ossea. Le ceramiche biodegradabili come i cementi fosfato di calcio (CPC) hanno mostrato un potenziale entusiasmante per il trattamento delle fratture da compressione vertebrale osteoporotica nella cifoplastica percutanea10. I CPC forniscono supporto meccanico per il corpo vertebrale fratturato e gradualmente si degradano dopo che la frattura è guarita.
Anche i polimeri biodegradabili, come alcuni polisaccaridi e poliesteri, sono stati ampiamente esplorati per applicazioni biomediche. Ad esempio, l’idrogel di chitosano come polisaccaride biodegradabile ha mostrato le sue capacità di prevenire le infezioni e rigenerare il tessuto cutaneo11. L’acido poli-L-lattico (PLLA), il poli(acido glicolico) (PGA) e l’acido poli-lattico-co-glicolico (PLGA) sono poliesteri ampiamente studiati per la fabbricazione di scaffold porosi 2D o 3D per applicazioni di ingegneria tissutale12,13,14. Inoltre, i materiali compositi integrano due o più fasi di metalli, ceramiche e polimeri per fornire funzioni avanzate per una vasta gamma di applicazioni biomediche15,16,17. Ad esempio, i compositi PLGA e fosfato di calcio possono essere utilizzati per fabbricare scaffold biodegradabili per applicazioni come la riparazione di difetti ossei del cranio18. Questi scaffold e impianti biodegradabili potrebbero supportare e promuovere la crescita di cellule e tessuti e quindi degradarsi gradualmente nel corpo nel tempo.
Come mostrato nella Tabella supplementare 1, diversi materiali biodegradabili possono avere vari meccanismi di degradazione, prodotti e tassi. Ad esempio, le leghe di magnesio, come Mg-2 wt % Zn-0,5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19 e Mg-9 wt% Al-1 wt% Zinc (AZ91)20, si degradano reagendo con l’acqua e i loro prodotti di degradazione includono principalmente ioni Mg2+, ioni OH–, gas H2 e deposizioni minerali. Il tasso di degradazione per i metalli biodegradabili varia a seconda delle loro diverse composizioni, geometrie e ambienti di degrado. Ad esempio, Cipriano et al.19 hanno riferito che i fili ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) hanno perso l’85% di massa mentre i fili Mg puri con la stessa geometria hanno perso il 40% di massa dopo essere stati impiantati nelle tibie di ratto per 47 giorni. I materiali ceramici biodegradabili come l’idrossiapatite (HA) e il fosfato β-tricalcico (β-TCP) possono degradarsi attraverso la dissoluzione del liquido extracellulare guidato dalla soluzione o scomporsi in piccole particelle e quindi degradarsi attraverso la dissoluzione liquida extracellulare e i processi di riassorbimento cellulo-mediati. I prodotti di degradazione di queste ceramiche a base di fosfato di calcio possono includere ioni Ca2+, ioni (PO4)3-, ioni OH– e deposizioni minerali21. Il tasso di degradazione per le ceramiche di fosfato di calcio è significativamente influenzato dalle loro strutture cristalline. Ad esempio, Van Blitterswijk et al.22 hanno riferito che l’HA con micropori al 40 vol.% non ha perso massa mentre β-TCP con micropori al 40% ha perso il 30± 4% di massa dopo essere stato impiantato nelle tibie dei conigli per 3 mesi. Polimeri come PLGA14,23 possono degradarsi a causa dell’idrolisi dei legami estere in presenza di acqua, e i prodotti di degradazione includono principalmente acidi lattico e glicolico. Potrebbe essere necessario un mese per PLGA 50/50 e diversi mesi per PLGA 95/5 per ottenere la completa degradazione24.
I test di risposta cellulare e citocompatibilità sono fondamentali per valutare e vagliare questi materiali implantari biodegradabili per applicazioni biomediche. Tuttavia, gli attuali standard dell’Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO), come ISO 10993-5:2009 “Valutazione biologica dei dispositivi medici-Parte 5 Test per la citotossicità in vitro“, sono stati inizialmente progettati per valutare la citotossicità di biomateriali non degradabili come le leghe Ti e le leghe Cr-Co in vitro25. In particolare, ISO 10993-5:2009 copre solo i test di citotossicità in vitro dell’estratto, il contatto diretto e i test di contatto indiretto. Nel test di estrazione, l’estratto viene preparato immergendo i campioni in fluidi di estrazione come terreni di coltura con siero e soluzioni saline fisiologiche in una delle condizioni standard di tempo e temperatura. L’estratto o la diluizione raccolti viene quindi aggiunto nella coltura cellulare per studiare la citotossicità. Per il test di contatto diretto, il contatto diretto tra campione e cellule si ottiene posizionando il campione di prova sullo strato cellulare stabilito (aderito). Nel test di contatto indiretto, il terreno di coltura contenente siero e agar fuso viene pipettato per coprire le cellule stabilite. Il campione viene quindi posto sullo strato di agar solidificato con o senza filtro.
Gli standard ISO hanno mostrato alcune limitazioni quando applicati per valutare materiali biodegradabili in vitro. A differenza dei materiali non degradabili, i comportamenti di degradazione dei materiali biodegradabili sono dinamici e possono cambiare in un momento diverso o in varie condizioni ambientali (ad esempio, temperatura, umidità, composizione dei media e tipo di cella). Il test dell’estratto valuta solo la citotossicità dei prodotti di degradazione del materiale e non riflette il processo dinamico di degradazione del campione. Sia i test di contatto diretto che indiretto dello standard ISO caratterizzano solo le interazioni tra le cellule e i campioni stabiliti. Inoltre, nel test di contatto indiretto, i materiali e le cellule si trovano in microambienti diversi che non riflettono l’ambiente in vivo e non catturano la degradazione dinamica dei materiali biodegradabili.
L’obiettivo di questo articolo è quello di introdurre e discutere i metodi di test di citocompatibilità per vari materiali implantari biodegradabili per affrontare le limitazioni sopra menzionate dei metodi descritti negli attuali standard ISO. I metodi presentati in questo articolo considerano il comportamento di degradazione dinamica dei materiali implantari e le diverse circostanze delle interazioni cellula-materiale in vivo. In particolare, questo articolo fornisce tre metodi di test di citocompatibilità, vale a dire coltura diretta, coltura a esposizione diretta e coltura di esposizione per vari materiali biodegradabili, tra cui polimeri biodegradabili, ceramiche, metalli e loro compositi per applicazioni implantari mediche.
Nel metodo di coltura diretta, le cellule sospese nei terreni di coltura vengono seminate direttamente sui campioni, valutando così le interazioni tra le cellule appena seminate e gli impianti. Nella coltura a esposizione diretta, i campioni vengono posizionati direttamente sullo strato cellulare stabilito per imitare le interazioni degli impianti con le cellule ospiti stabilite nel corpo. Nella coltura di esposizione, i campioni vengono collocati nei rispettivi inserti del pozzo e quindi introdotti nei pozzetti di coltura con cellule stabilite, che caratterizzano le risposte delle cellule stabilite ai cambiamenti nell’ambiente locale indotti dalla degradazione dell’impianto quando non hanno alcun contatto diretto con gli impianti. I metodi di coltura diretta e di coltura ad esposizione diretta valutano le cellule direttamente o indirettamente a contatto con i materiali implantari nello stesso pozzo di coltura. La coltura di esposizione caratterizza le cellule indirettamente a contatto con i materiali implantari entro una distanza prescritta nello stesso pozzo di coltura.
Questo articolo presenta una descrizione dettagliata dei test di citocompatibilità per diversi materiali biodegradabili e delle loro interazioni con cellule modello, cioè cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BMSC). I protocolli includono la raccolta, la coltivazione, la semina, il fissaggio, la colorazione e l’imaging delle cellule, insieme alle analisi dei materiali e dei mezzi di post-coltura, che si applicano a una varietà di materiali implantari biodegradabili e a una vasta gamma di tipi di cellule. Questi metodi sono utili per lo screening di materiali biodegradabili per diverse applicazioni biomediche in termini di risposte cellulari e citocompatibilità in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi metodi di coltura cellulare possono essere utilizzati per valutare la citocompatibilità in vitro di biomateriali di interesse per vari aspetti delle applicazioni in vivo. Questo articolo dimostra tre metodi di coltura in vitro , vale a dire, coltura diretta, coltura ad esposizione diretta e coltura di esposizione, per imitare diversi scenari in vivo in cui vengono utilizzati materiali implantari biodegradabili all’interno del corpo umano. Il metodo di coltura diretta viene uti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori apprezzano il sostegno finanziario della National Science Foundation degli Stati Uniti (premio NSF CBET 1512764 e NSF PIRE 1545852), del National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), della University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship e del Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) e UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Gli autori apprezzano la Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) presso l’UC-Riverside per l’uso di SEM / EDS e il Dr. Perry Cheung per l’uso di strumenti XRD. Gli autori apprezzano anche Thanh Vy Nguyen e Queenie Xu per il montaggio parziale. Gli autori desiderano anche ringraziare Cindy Lee per aver registrato la narrazione per il video. Eventuali opinioni, risultati e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation o del National Institutes of Health.
Materials
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
References
- Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
- Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
- Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212 (2018).
- Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
- Wu, C. -. C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
- Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
- Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614 (2020).
- Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
- Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
- Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
- Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
- Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
- Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
- Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
- Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410 (2017).
- Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
- Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
- Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
- Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
- Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
- Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
- Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
- Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
- Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
- Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
- Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
- Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
- Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904 (2020).
- Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018 (2018).
- Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157 (2014).
- Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
- Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
- Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
- Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
- Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
- Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
- Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
- Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
- Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
- Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
- Wetteland, C. L., Nguyen, N. -. Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
- Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
- Wang, H. . Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , (2004).
