生分解性インプラント材料をインビトロで研究するための直接的および間接的な培養方法
Summary
生分解性インプラント材料の in vitro 細胞適合性を評価するための直接培養、直接暴露培養、および暴露培養の3つの方法を紹介します。これらのインビ トロ法は 、異なる インビボ 細胞-インプラント相互作用を模倣し、様々な生分解性材料の研究に適用することができる。
Abstract
過去数十年にわたり、生分解性材料は、整形外科、歯科、および頭蓋顎顔面インプラントなどの生物医学的用途のために広く探求されてきた。生物医学的用途のために生分解性材料をスクリーニングするためには、これらの材料を in vitro 細胞応答、細胞適合性、および細胞毒性の観点から評価する必要がある。国際標準化機構(ISO)規格は、生体材料の評価に広く利用されています。しかし、ほとんどのISO規格はもともと非分解性材料の細胞毒性を評価するために設立されたため、生分解性材料のスクリーニングには限られた価値しか提供されていません。
本稿では、生分解性ポリマー、セラミックス、金属、およびそれらの複合体を含む生分解性インプラント材料の in vitro 細胞適合性を異なる細胞種で評価するための、直接培養法、直接暴露培養法、および暴露培養法の3つの異なる培養方法を紹介し、議論する。研究は、培養方法が生分解性材料に対する細胞応答に影響を与えることを示しており、その動的分解は界面および局所環境において時空間的な違いを誘発する。具体的には、直接培養法は、インプラントに直接播種された細胞の応答を明らかにする。直接暴露培養法は、インプラントと接触する確立された宿主細胞の応答を解明する。暴露培養法は、インプラントに直接接触していないが、インプラントの劣化による局所環境の変化の影響を受けている確立された宿主細胞を評価する。
この記事では、生分解性インプラント材料のインビトロ細胞適合性および骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)との相互作用を研究するためのこれら3つの培養方法の例を提供する。また、収穫、継代、培養、種子、固定、染色、細胞の特性評価、培養後の培地および材料の分析方法についても説明します。この記事で説明するインビトロ方法は、インビボ環境のさまざまなシナリオを模倣し、さまざまな生物医学的用途に対するさまざまな生体材料のインビトロ細胞適合性試験の適用性と関連性を広げます。
Introduction
何十年もの間、生分解性材料は、整形外科1,2、歯科3,4、頭蓋顎顔面5などの生物医学的用途で広く研究され、使用されてきました。永久的なインプラントや材料とは異なり、生分解性金属、セラミックス、ポリマー、およびそれらの複合材料は、生理学的環境における異なる化学反応を介して時間の経過とともに体内で徐々に分解する。例えば、マグネシウム(Mg)合金1,6,7や亜鉛(Zn)合金8,9などの生分解性金属は、骨固定装置用の有望な材料である。それらの生分解性は、骨治癒後にインプラントを除去するための二次手術の必要性を排除する可能性がある。リン酸カルシウムセメント(CPC)などの生分解性セラミックスは、経皮的脊柱後弯形成術における骨粗鬆症性椎体圧迫骨折の治療にエキサイティングな可能性を示しています10。CPCは、骨折した椎体に機械的サポートを提供し、骨折が治癒した後に徐々に劣化する。
いくつかの多糖類やポリエステルなどの生分解性ポリマーも、生物医学的用途のために広く探求されている。例えば、生分解性多糖類としてのキトサンハイドロゲルは、感染予防や皮膚組織の再生にその能力を発揮しています11。ポリ-L-乳酸(PLLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、およびポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)は、組織工学用途のための2Dまたは3D多孔質足場を製造するための広く研究されているポリエステルである12,13,14。さらに、複合材料は、金属、セラミック、ポリマーの2つ以上の相を統合して、幅広い生物医学的用途に高度な機能を提供します15,16,17。例えば、PLGAおよびリン酸カルシウム複合体は、頭蓋骨欠損の修復などの用途のための生分解性足場を作製するために使用することができる18。これらの生分解性足場とインプラントは、細胞や組織の成長を支え、促進し、時間の経過とともに体内で徐々に分解する可能性があります。
補足表1に示すように、異なる生分解性材料は、様々な分解機構、生成物、および速度を有し得る。例えば、マグネシウム合金、例えば、Mg-2重量%Zn-0.5重量%Ca(ZC21)1、Mg-4重量%Zn-1重量%Sr(ZSr41)19、およびMg-9重量%Al-1重量%亜鉛(AZ91)20は、水と反応して分解し、それらの分解生成物は、主にMg2+イオン、OH-イオン、H2ガス、および鉱物堆積物を含む。生分解性金属の分解速度は、その異なる組成、形状、および分解環境によって異なります。例えば、Cipriano et al.19は、ZSr41ワイヤー(Ø1.1 × 15mm)が85%の質量を失い、同じ形状の純粋なMgワイヤーがラットの脛骨に47日間移植された後、40%の質量を失ったと報告した。ハイドロキシアパタイト(HA)やリン酸β三カルシウム(β-TCP)などの生分解性セラミック材料は、溶液駆動の細胞外液体溶解を介して分解するか、小さな粒子に分解し、細胞外液体溶解および細胞媒介再吸収プロセスの両方を介して分解することができる。これらのリン酸カルシウム系セラミックスの分解生成物には、Ca2+イオン、(PO4)3-イオン、OH-イオン、およびミネラル堆積物が含まれ得る21。リン酸カルシウムセラミックスの分解速度は、その結晶構造によって大きく影響される。例えば、Van Blitterswijk et al.22は、40体積%のマイクロポアを有するHAは質量を失わず、40体積%のマイクロポアを有するβ-TCPはウサギの脛骨に3ヶ月間移植された後、30±4%の質量を失ったと報告した。PLGA14,23などのポリマーは、水の存在下でのエステル結合の加水分解により分解する場合があり、分解生成物には、主に乳酸およびグリコール酸が含まれる。PLGA 50/50 では 1 か月、PLGA 95/5 では完全な劣化に達するまでに数か月かかる場合があります24。
細胞応答および細胞適合性試験は、生物医学的用途のためにこれらの生分解性インプラント材料を評価およびスクリーニングするために重要である。しかし、ISO 10993-5:2009「医療機器の生物学的評価-第5部インビトロ細胞毒性試験」などの国際標準化機構(ISO)の現在の規格は、当初、Ti合金やCr-Co合金などの非分解性生体材料の細胞毒性をin vitro25で評価するために設計されました。具体的には、ISO 10993-5:2009は、抽出物のインビトロ細胞毒性試験、直接接触試験、および間接接触試験のみをカバーしています。抽出物試験において、抽出物は、標準時間および温度条件のいずれかで血清および生理食塩水と共に培養培地などの抽出流体にサンプルを浸漬することによって調製される。次いで、回収した抽出物または希釈液を細胞培養物に添加して、細胞毒性を研究する。直接接触試験の場合、試料と細胞との直接接触は、確立された(接着された)細胞層上に試験試料を配置することによって達成される。間接接触試験では、血清および融解寒天を含む培養培地をピペットで固定し、樹立細胞を覆う。次いで、試料を、フィルターの有無にかかわらず、固化した寒天層上に置く。
ISO規格は、 インビトロで生分解性材料を評価するために適用された場合、いくつかの制限を示しています。非分解性材料とは異なり、生分解性材料の分解挙動は動的であり、異なる時間または様々な環境条件(例えば、温度、湿度、培地組成、および細胞型)で変化し得る。抽出物試験は、材料の分解産物の細胞毒性を評価するのみであり、サンプル分解の動的プロセスを反映していない。ISO規格の直接接触試験と間接接触試験は、確立された細胞とサンプル間の相互作用を特徴付けるだけです。さらに、間接接触試験では、材料および細胞は、 in vivo 環境を反映しず、生分解性材料の動的分解を捕捉しない異なる微小環境にある。
この記事の目的は、現在のISO規格に記載されている方法の上記の制限に対処するために、さまざまな生分解性インプラント材料の細胞適合性試験方法を紹介し、議論することです。本稿で紹介する手法は、インプラント材料の動的分解挙動と 、生体内における細胞-材料相互作用のさまざまな状況を考慮する。具体的には、この記事では、医療用インプラント用途の生分解性ポリマー、セラミック、金属、およびそれらの複合材料を含む様々な生分解性材料の直接培養、直接暴露培養、および暴露培養の3つの細胞適合性試験方法を提供する。
直接培養法では、培地に懸濁した細胞をサンプルに直接播種し、新たに播種した細胞とインプラントとの相互作用を評価します。直接暴露培養では、サンプルを樹立された細胞層に直接配置して、インプラントと体内の樹立宿主細胞との相互作用を模倣します。暴露培養では、サンプルをそれぞれのウェルインサートに入れ、次いで樹立細胞と共に培養ウェルに導入し、インプラントと直接接触しない場合のインプラント分解によって誘発される局所環境の変化に対する樹立細胞の応答を特徴付ける。直接培養法および直接暴露培養法では、同じ培養ウェル内の移植材料と接触する細胞を直接的または間接的に評価する。曝露培養は、同じ培養ウェル内で所定の距離内でインプラント材料と間接的に接触する細胞を特徴付ける。
この記事では、さまざまな生分解性材料の細胞適合性試験と、モデル細胞、つまり骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)との相互作用について詳しく説明します。プロトコルには、細胞の採取、培養、播種、固定、染色、イメージング、および後培養材料および培地の分析が含まれ、これらはさまざまな生分解性インプラント材料および幅広い細胞タイプに適用されます。これらの方法は、 インビトロでの細胞応答および細胞適合性の点で、異なる生物医学的用途のための生分解性材料をスクリーニングするのに有用である。
Protocol
Representative Results
Discussion
異なる細胞培養法を用いて、インビボでの適用の様々な態様について、目的とする生体材料のインビトロ細胞適合性を評価することができる。この記事では、生分解性インプラント材料が人体内で使用されるさまざまなin vivoシナリオを模倣するために、3つのインビトロ培養方法、すなわち、直接培養、直接暴露培養、および暴露培養を実証する。直接培養法は、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、米国国立科学財団(NSF CBET賞1512764およびNSF PIRE 1545852)、国立衛生研究所(NIH NIDCR 1R03DE028631)、カリフォルニア大学(UC)リージェンツ教員開発フェローシップ、および研究種子助成金委員会(Huinan Liu)、およびUC-Riverside Dissertation Research Grant(Jiajia Lin)からの財政的支援に感謝している。著者らは、UC-RiversideのAdvanced Microscopy and Microanalysis(CFAMM)がSEM/EDSを使用し、Perry Cheung博士がXRD装置を使用したことを高く評価している。著者らはまた、部分的な編集のためにThanh Vy NguyenとQueenie Xuを高く評価している。著者はまた、ビデオのナレーションを録音してくれたシンディ・リーに感謝したいと思います。この記事で表明された意見、所見、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしも国立科学財団または国立衛生研究所の見解を反映するものではありません。
Materials
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
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