Méthodes de culture directe et indirecte pour l’étude de matériaux implantaires biodégradables in vitro
Summary
Nous introduisons trois méthodes de culture directe, la culture d’exposition directe et la culture d’exposition pour évaluer la cytocompatibilité in vitro des matériaux d’implants biodégradables. Ces méthodes in vitro imitent différentes interactions cellule-implant in vivo et peuvent être appliquées pour étudier divers matériaux biodégradables.
Abstract
Au cours des dernières décennies, les matériaux biodégradables ont été largement explorés pour des applications biomédicales telles que les implants orthopédiques, dentaires et craniomaxillo-faciaux. Pour dépister les matériaux biodégradables pour des applications biomédicales, il est nécessaire d’évaluer ces matériaux en termes de réponses cellulaires in vitro , de cytocompatibilité et de cytotoxicité. Les normes de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) ont été largement utilisées dans l’évaluation des biomatériaux. Cependant, la plupart des normes ISO ont été établies à l’origine pour évaluer la cytotoxicité des matériaux non dégradables, offrant ainsi une valeur limitée pour le dépistage des matériaux biodégradables.
Cet article présente et discute trois méthodes de culture différentes, à savoir la méthode de culture directe, la méthode de culture d’exposition directe et la méthode de culture d’exposition pour évaluer la cytocompatibilité in vitro de matériaux d’implants biodégradables, y compris les polymères biodégradables, les céramiques, les métaux et leurs composites, avec différents types de cellules. La recherche a montré que les méthodes de culture influencent les réponses cellulaires aux matériaux biodégradables parce que leur dégradation dynamique induit des différences spatio-temporelles à l’interface et dans l’environnement local. Plus précisément, la méthode de culture directe révèle les réponses des cellules ensemencées directement sur les implants; la méthode de culture par exposition directe élucide les réponses des cellules hôtes établies entrant en contact avec les implants; et la méthode de culture d’exposition évalue les cellules hôtes établies qui ne sont pas en contact direct avec les implants, mais qui sont influencées par les changements dans l’environnement local dus à la dégradation des implants.
Cet article fournit des exemples de ces trois méthodes de culture pour étudier la cytocompatibilité in vitro des matériaux implantaires biodégradables et leurs interactions avec les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Il décrit également comment récolter, passer, cultiver, semer, fixer, tacher, caractériser les cellules et analyser les milieux et les matériaux de postculture. Les méthodes in vitro décrites dans cet article imitent différents scénarios de l’environnement in vivo , élargissant l’applicabilité et la pertinence des tests de cytocompatibilité in vitro de différents biomatériaux pour diverses applications biomédicales.
Introduction
Pendant des décennies, les matériaux biodégradables ont été largement étudiés et utilisés dans des applications biomédicales telles que les applications orthopédiques1,2, dentaires3,4 et craniomaxillo-faciales5. Contrairement aux implants et aux matériaux permanents, les métaux biodégradables, les céramiques, les polymères et leurs composites se dégradent progressivement dans le corps au fil du temps via différentes réactions chimiques dans l’environnement physiologique. Par exemple, les métaux biodégradables tels que les alliages de magnésium (Mg)1,6,7 et les alliages de zinc (Zn)8,9 sont des matériaux prometteurs pour les dispositifs de fixation osseuse. Leur biodégradabilité pourrait éliminer la nécessité de chirurgies secondaires pour retirer les implants après la cicatrisation osseuse. Les céramiques biodégradables telles que les ciments de phosphate de calcium (CPC) ont montré un potentiel intéressant pour le traitement des fractures ostéoporotiques de compression vertébrale dans la cyphoplastie percutanée10. Les CPC fournissent un soutien mécanique au corps vertébral fracturé et se dégradent progressivement après la guérison de la fracture.
Les polymères biodégradables, tels que certains polysaccharides et polyesters, ont également été largement explorés pour des applications biomédicales. Par exemple, l’hydrogel de chitosane en tant que polysaccharide biodégradable a montré ses capacités à prévenir les infections et à régénérer les tissus cutanés11. L’acide poly-L-lactique (PLLA), l’acide poly(glycolique) (PGA) et le poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) sont des polyesters largement étudiés pour la fabrication d’échafaudages poreux 2D ou 3D pour des applications d’ingénierie tissulaire12,13,14. De plus, les matériaux composites intègrent deux phases ou plus de métaux, de céramiques et de polymères pour fournir des fonctions avancées pour un large éventail d’applications biomédicales15,16,17. Par exemple, les composites PLGA et phosphate de calcium peuvent être utilisés pour fabriquer des échafaudages biodégradables pour des applications telles que la réparation des défauts osseux du crâne18. Ces échafaudages et implants biodégradables pourraient soutenir et favoriser la croissance des cellules et des tissus, puis se dégrader progressivement dans le corps au fil du temps.
Comme le montre le tableau supplémentaire 1, différents matériaux biodégradables peuvent avoir des mécanismes, des produits et des taux de dégradation variés. Par exemple, les alliages de magnésium, tels que Mg-2 % en poids de Zn-0,5 % en poids de Ca (ZC21)1, Mg-4 % en poids de Zn-1 % en poids de Sr (ZSr41)19 et Mg-9 % en poids d’Al-1 % en poids de zinc (AZ91)20, se dégradent en réagissant avec l’eau, et leurs produits de dégradation comprennent principalement des ions Mg2+, des ions OH–, du gaz H2 et des dépôts minéraux. Le taux de dégradation des métaux biodégradables varie en fonction de leurs différentes compositions, géométries et environnements de dégradation. Par exemple, Cipriano et al.19 ont rapporté que les fils ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) perdaient 85 % de masse tandis que les fils Mg purs de même géométrie perdaient 40 % de masse après avoir été implantés dans les tibias du rat pendant 47 jours. Les matériaux céramiques biodégradables tels que l’hydroxyapatite (HA) et le phosphate β-tricalcique (β-TCP) peuvent se dégrader par dissolution liquide extracellulaire entraînée par solution ou se décomposer en petites particules, puis se dégrader via des processus de dissolution liquide extracellulaire et de résorption à médiation cellulaire. Les produits de dégradation de ces céramiques à base de phosphate de calcium peuvent inclure des ions Ca2+, des ions (PO4)3-, des ions OH– et des dépôts minéraux21. Le taux de dégradation des céramiques de phosphate de calcium est significativement affecté par leurs structures cristallines. Par exemple, Van Blitterswijk et al.22 ont rapporté que l’AH avec des micropores à 40 % vol. n’a pas perdu de masse tandis que β-TCP avec 40 % vol.% de micropores a perdu 30 ± 4 % de masse après avoir été implanté dans les tibias de lapins pendant 3 mois. Les polymères tels que PLGA14,23 peuvent se dégrader en raison de l’hydrolyse des liaisons esters en présence d’eau, et les produits de dégradation comprennent principalement les acides lactique et glycolique. Il peut s’écouler un mois avant que PLGA 50/50 et PLGA 95/5 n’atteigne une dégradation complète24.
Les tests de réponse cellulaire et de cytocompatibilité sont essentiels pour évaluer et dépister ces matériaux implantaires biodégradables pour des applications biomédicales. Cependant, les normes actuelles de l’Organisation internationale de normalisation (ISO), telles que l’ISO 10993-5:2009 « Évaluation biologique des dispositifs médicaux – Partie 5 Tests de cytotoxicité in vitro », ont été initialement conçues pour évaluer la cytotoxicité de biomatériaux non dégradables tels que les alliages Ti et les alliages Cr-Co in vitro25. Plus précisément, l’ISO 10993-5:2009 ne couvre que les essais de cytotoxicité in vitro de l’extrait, les essais de contact direct et les essais de contact indirect. Dans le test d’extrait, l’extrait est préparé en immergeant des échantillons dans des fluides d’extraction tels que des milieux de culture avec du sérum et des solutions salines physiologiques dans l’une des conditions de temps et de température standard. L’extrait collecté ou la dilution est ensuite ajouté dans la culture cellulaire pour étudier la cytotoxicité. Pour l’essai de contact direct, le contact direct entre l’échantillon et les cellules est obtenu en plaçant l’échantillon d’essai sur la couche cellulaire établie (adhérée). Dans le test de contact indirect, le milieu de culture contenant du sérum et de la gélose fondue est pipeté pour recouvrir les cellules établies. L’échantillon est ensuite placé sur la couche de gélose solidifiée avec ou sans filtre.
Les normes ISO ont montré certaines limites lorsqu’elles sont appliquées pour évaluer les matériaux biodégradables in vitro. Contrairement aux matériaux non dégradables, les comportements de dégradation des matériaux biodégradables sont dynamiques et peuvent changer à un moment différent ou dans des conditions environnementales variées (par exemple, température, humidité, composition du milieu et type de cellule). L’essai d’extrait évalue uniquement la cytotoxicité des produits de dégradation du matériau et ne reflète pas le processus dynamique de dégradation de l’échantillon. Les tests de contact direct et indirect de la norme ISO ne caractérisent que les interactions entre les cellules établies et les échantillons. De plus, dans l’essai de contact indirect, les matériaux et les cellules se trouvent dans différents microenvironnements qui ne reflètent pas l’environnement in vivo et ne capturent pas la dégradation dynamique des matériaux biodégradables.
L’objectif de cet article est de présenter et de discuter des méthodes d’essai de cytocompatibilité pour divers matériaux d’implants biodégradables afin de répondre aux limites susmentionnées des méthodes décrites dans les normes ISO actuelles. Les méthodes présentées dans cet article prennent en compte le comportement de dégradation dynamique des matériaux implantaires et les différentes circonstances des interactions cellule-matériau in vivo. Plus précisément, cet article fournit trois méthodes de test de cytocompatibilité, à savoir la culture directe, la culture d’exposition directe et la culture d’exposition pour divers matériaux biodégradables, y compris les polymères biodégradables, les céramiques, les métaux et leurs composites pour les applications d’implants médicaux.
Dans la méthode de culture directe, les cellules en suspension dans le milieu de culture sont directement ensemencées sur les échantillons, évaluant ainsi les interactions entre les cellules nouvellement ensemencées et les implants. Dans la culture d’exposition directe, les échantillons sont placés directement sur la couche cellulaire établie pour imiter les interactions des implants avec les cellules hôtes établies dans le corps. Dans la culture d’exposition, les échantillons sont placés dans leurs inserts de puits respectifs, puis introduits dans les puits de culture avec des cellules établies, ce qui caractérise les réponses des cellules établies aux changements dans l’environnement local induits par la dégradation de l’implant lorsqu’elles n’ont pas de contact direct avec les implants. Les méthodes de culture directe et de culture par exposition directe évaluent les cellules directement ou indirectement en contact avec les matériaux de l’implant dans le même puits de culture. La culture d’exposition caractérise indirectement les cellules en contact avec les matériaux de l’implant à une distance prescrite dans le même puits de culture.
Cet article présente une description détaillée des tests de cytocompatibilité pour différents matériaux biodégradables et de leurs interactions avec les cellules modèles, c’est-à-dire les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Les protocoles comprennent la récolte, la culture, l’ensemencement, la fixation, la coloration et l’imagerie des cellules, ainsi que des analyses des matériaux et des milieux de postculture, qui s’appliquent à une variété de matériaux d’implants biodégradables et à un large éventail de types de cellules. Ces méthodes sont utiles pour le criblage de matériaux biodégradables pour différentes applications biomédicales en termes de réponses cellulaires et de cytocompatibilité in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Différentes méthodes de culture cellulaire peuvent être utilisées pour évaluer la cytocompatibilité in vitro de biomatériaux d’intérêt pour divers aspects d’applications in vivo. Cet article présente trois méthodes de culture in vitro , à savoir la culture directe, la culture d’exposition directe et la culture d’exposition, pour imiter différents scénarios in vivo où des matériaux d’implant biodégradables sont utilisés à l’intérieur du corps humain. La m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs apprécient le soutien financier de la National Science Foundation des États-Unis (NSF CBET award 1512764 et NSF PIRE 1545852), des National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), de la Regents Faculty Development Fellowship de l’Université de Californie (UC) et du Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) et de la UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Les auteurs apprécient le Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) à l’UC-Riverside pour l’utilisation du SEM/EDS et le Dr Perry Cheung pour l’utilisation des instruments XRD. Les auteurs apprécient également Thanh Vy Nguyen et Queenie Xu pour l’édition partielle. Les auteurs tiennent également à remercier Cindy Lee d’avoir enregistré la narration de la vidéo. Toutes les opinions, constatations et conclusions, ou recommandations exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation ou des National Institutes of Health.
Materials
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
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