Frattura trasversale del femore del topo con perno stabilizzante

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per eseguire fratture su topi adulti e monitorare il processo di guarigione.

Abstract

La riparazione della frattura è una funzione essenziale dello scheletro che non può essere modellata in modo affidabile in vitro. Un modello di lesione del topo è un approccio efficiente per verificare se un gene, un prodotto genico o un farmaco influenza la riparazione ossea perché le ossa murine ricapitolano le fasi osservate durante la guarigione delle fratture umane. Quando un topo o un essere umano rompe un osso, viene avviata una risposta infiammatoria e il periostio, una nicchia di cellule staminali che circonda l’osso stesso, viene attivato e si espande. Le cellule che risiedono nel periostio si differenziano quindi per formare un callo molle vascolarizzato. La transizione dal callo molle a un callo duro avviene quando le cellule progenitrici scheletriche reclutate si differenziano in cellule mineralizzanti e il ponte delle estremità fratturate si traduce nell’unione ossea. Il callo mineralizzato subisce quindi un rimodellamento per ripristinare la forma e la struttura originali dell’osso guarito. La guarigione delle fratture è stata studiata nei topi utilizzando vari modelli di lesioni. Tuttavia, il modo migliore per ricapitolare l’intero processo biologico è quello di sfondare la sezione trasversale di un osso lungo che comprende entrambe le cortecce. Questo protocollo descrive come una frattura del femore trasversale stabilizzata può essere eseguita in modo sicuro per valutare la guarigione nei topi adulti. Viene inoltre fornito un protocollo chirurgico che include tecniche dettagliate di raccolta e imaging per caratterizzare le diverse fasi della guarigione delle fratture.

Introduction

Fratture, rotture nella continuità della superficie ossea, si verificano in tutti i segmenti della popolazione. Diventano gravi nelle persone che hanno ossa fragili a causa dell’invecchiamento o della malattia e i costi sanitari delle fratture da fragilità dovrebbero superare i 25 miliardi di dollari in 5 anni 1,2,3,4,5. Comprendere i meccanismi biologici coinvolti nella riparazione delle fratture sarebbe un punto di partenza per lo sviluppo di nuove terapie volte a migliorare il processo di guarigione. Ricerche precedenti hanno dimostrato che, dopo la frattura, si verificano quattro passaggi significativi che consentono all’osso di guarire: (1) formazione dell’ematoma; (2) formazione di un callo fibrocartilagineo; (3) mineralizzazione del callo molle per formare l’osso; e (4) rimodellamento dell’osso guarito ^6,7. Molti processi biologici sono attivati per guarire con successo la frattura. In primo luogo, una risposta pro-infiammatoria acuta viene avviata immediatamente dopo una frattura ^6,7. Quindi, il periostio si attiva e si espande, e le cellule periosteali si differenziano in condrociti per formare un callo cartilagineo che cresce per riempire il vuoto lasciato dai segmenti ossei interrotti 6,7,8,9. Le cellule neurali e vascolari invadono il callo appena formato per fornire ulteriori cellule e molecole di segnalazione necessarie per facilitare la riparazione 6,7,8,9,10. Oltre a contribuire alla formazione del callo, le cellule periosteali si differenziano anche in osteoblasti che depongono l’osso tessuto nel callo ponte. Infine, gli osteoclasti rimodellano l’osso appena formato per tornare alla sua forma originale e alla struttura lamellare 7,8,9,10,11. Molti gruppi hanno sviluppato modelli murini di riparazione delle fratture. Uno dei primi e più spesso utilizzati modelli di frattura nei topi è l’approccio Einhorn, in cui un peso viene lasciato cadere sulla gamba da un’altezza specifica¹². La mancanza di controllo sull’angolo e la forza applicata per indurre la frattura crea molta variabilità nella posizione e nelle dimensioni della discontinuità ossea. Successivamente, si traduce in variazioni nella specifica risposta di guarigione della frattura osservata. Altri approcci popolari sono l’intervento chirurgico per produrre un difetto monocorticale tibiale o fratture da stress, procedure che inducono risposte di guarigione relativamente più lievi^10,13. La variabilità in questi modelli è dovuta principalmente alla persona che conduce la procedura¹⁴.

Qui, un modello dettagliato di lesione del femore del topo consente il controllo della rottura per fornire una lesione riproducibile e consentire una valutazione quantitativa e qualitativa della riparazione della frattura del femore. In particolare, viene introdotta una svolta completa nei femori dei topi adulti e stabilizza le estremità della frattura per tenere conto del ruolo che il carico fisico gioca nella guarigione ossea. I metodi per la raccolta dei tessuti e l’imaging delle diverse fasi del processo di guarigione utilizzando l’istologia e la tomografia microinciuta (microCT) sono anche forniti in dettaglio.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee dell’Harvard Medical Area. In questo protocollo sono stati utilizzati topi C57BL/6J di 12 settimane (maschi e femmine). I topi maschi e femmine C57BL / 6J raggiungono il picco di massa ossea intorno alle 12 settimane di età con i femori abbastanza larghi da adattarsi a un perno stabilizzatore, rendendoli un ceppo appropriato da utilizzare per questo protocollo15. <p class="jove_…

Representative Results

Nei topi C57BL / 6J, un intervento chirurgico di successo completa le fasi di guarigione menzionate in precedenza con poca o nessuna risposta infiammatoria locale o coinvolgimento periostale nel femore controlaterale operato da finzione. Un ematoma si forma poche ore dopo l’intervento chirurgico e il periostio viene attivato per reclutare progenitori scheletrici per la condrogenesi. Varie popolazioni cellulari, come i progenitori mesenchimali Prx1+, possono essere rintracciate durante il processo di riparazion…

Discussion

Il modello di lesione dettagliato in questo protocollo comprende tutti e quattro i passaggi significativi osservati durante la guarigione delle fratture spontanee, tra cui (1) risposta pro-infiammatoria con la formazione dell’ematoma, (2) reclutamento di progenitori scheletrici dal periostio per formare il callo molle, (3) mineralizzazione del callo da parte degli osteoblasti e (4) rimodellamento dell’osso da parte degli osteoclasti.

La procedura chirurgica descritta in questo manoscritto è o…

Materials

23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle	BD precision	305193	Use as guide needle
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm)	BD precision	305136	Use as stabilizing pin
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit	Braintree Scientific, INC	ACS-KIT
Alcian Blue 8 GX	Electron Microscopy Sciences	10350
Ammonium hydroxide	Millipore Sigma	AX1303
Circular blade X926.7 THIN-FLEX	Abrasive technologies	CELBTFSG633
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit	Dremel	7700 1/15
Eosin Y	ThermoScientific	7111
Fine curved dissecting forceps	VWR	82027-406
Hematoxulin Gill 2	Sigma-Aldrich	GHS216
Hydrochloric acid	Millipore Sigma	HX0603-4
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Microsurgical kit	VWR	95042-540
Orange G	Sigma-Aldrich	1625
Phloxine B	Sigma-Aldrich	P4030
Povidone-Iodine Swabs	PDI	S23125
SCANCO Medical µCT35	Scanco
Slow-release buprenorphine	Zoopharm