Fratura transversa do fêmur do rato com pino estabilizador
Summary
Este protocolo descreve um método para realizar fraturas em camundongos adultos e monitorar o processo de cura.
Abstract
O reparo da fratura é uma função essencial do esqueleto que não pode ser modelado de forma confiável in vitro. Um modelo de lesão do camundongo é uma abordagem eficiente para testar se um gene, produto genético ou droga influencia a reparação óssea porque os ossos da murina recapitulam os estágios observados durante a cicatrização da fratura humana. Quando um rato ou humano quebra um osso, uma resposta inflamatória é iniciada, e o periosteum, um nicho de células-tronco ao redor do próprio osso, é ativado e se expande. As células que residem no periósteo então se diferenciam para formar um calo macio vascularizado. A transição do calo macio para um calo duro ocorre à medida que as células progenitoras esqueléticas recrutadas se diferenciam em células mineralizadoras, e a ponte das extremidades fraturadas resulta na união óssea. O calo mineralizado passa então por remodelação para restaurar a forma original e a estrutura do osso curado. A cicatrização de fraturas tem sido estudada em camundongos usando vários modelos de lesões. Ainda assim, a melhor maneira de recapitular todo esse processo biológico é romper a seção transversal de um osso longo que engloba ambos os cortices. Este protocolo descreve como uma fratura de fêmur transversal estabilizada pode ser realizada com segurança para avaliar a cicatrização em camundongos adultos. Também é fornecido um protocolo cirúrgico, incluindo técnicas detalhadas de colheita e imagem para caracterizar os diferentes estágios de cicatrização da fratura.
Introduction
Fraturas, quebras na continuidade da superfície óssea, ocorrem em todos os segmentos da população. Eles se tornam graves em pessoas que têm ossos frágeis devido ao envelhecimento ou doença, e os custos de cuidados de saúde das fraturas por fragilidade devem ultrapassar US$ 25 bilhões em 5 anos 1,2,3,4,5. Compreender os mecanismos biológicos envolvidos na reparação de fraturas seria um ponto de partida no desenvolvimento de novas terapias visando melhorar o processo de cicatrização. Pesquisas anteriores mostraram que, após a fratura, ocorrem quatro etapas significativas que permitem curar o osso: (1) formação do hematoma; (2) formação de calo fibrocartilagino; (3) mineralização do calo macio para formar osso; e (4) remodelação do osso curado6,7. Muitos processos biológicos são ativados para curar a fratura com sucesso. Primeiro, uma resposta aguda pró-inflamatória é iniciada imediatamente após uma fraturade 6,7. Em seguida, o periosteum se torna ativado e se expande, e as células periosteais se diferenciam em condrócitos para formar um calo de cartilagem que cresce para preencher a lacuna deixada pelos segmentos ósseos rompidos 6,7,8,9. Células neurais e vasculares invadem o calo recém-formado para fornecer células adicionais e moléculas de sinalização necessárias para facilitar a reparaçãode 6,7,8, 9,10. Além de contribuir para a formação do calo, as células periosteais também se diferenciam em osteoblastos que estabelecem osso tecido no calo de ponte. Finalmente, os osteoclartos remodelam o osso recém-formado para retornar à sua forma original e estrutura lamelar 7,8,9,10,11. Muitos grupos desenvolveram modelos de camundongos de reparo de fraturas. Um dos modelos de fratura mais antigos e mais usados em camundongos é a abordagem Einhorn, onde um peso é caído na perna a partir de uma altura específica12. A falta de controle sobre o ângulo e a força aplicada para induzir a fratura cria muita variabilidade na localização e tamanho da descontinuidade óssea. Posteriormente, resulta em variações na resposta específica de cicatrização da fratura observada. Outras abordagens populares são a intervenção cirúrgica para produzir um defeito monocortical tibial ou fraturas por estresse, procedimentos que induzem respostas de cura relativamente mais brandas10,13. A variabilidade nesses modelos deve-se principalmente à pessoa que conduz o procedimento14.
Aqui, um modelo detalhado de lesão do fêmur do camundongo permite o controle sobre a ruptura para fornecer uma lesão reprodutível e permitir uma avaliação quantitativa e qualitativa da reparação da fratura do fêmur. Especificamente, um completo avanço nos fêmures de camundongos adultos é introduzido e estabiliza as extremidades da fratura para explicar o papel do carregamento físico na cicatrização óssea. Os métodos de colheita de tecidos e imagem das diferentes etapas do processo de cura utilizando histologia e tomografia microcomputada (microCT) também são fornecidos em detalhes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo de lesão detalhado neste protocolo abrange todos os quatro passos significativos observados durante a cicatrização de fraturas espontâneas, incluindo (1) resposta pró-inflamatória com a formação do hematoma, (2) recrutamento de progenitores esqueléticos do periósteo para formar o calo macio, (3) mineralização do calo por osteoblastos e (4) remodelação do osso por osteoclasstos.
O procedimento cirúrgico descrito neste manuscrito é otimizado para camundongos adultos com …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Vicki Rosen pelo apoio financeiro e orientação com o projeto. Também gostaríamos de agradecer aos veterinários e funcionários da IACUC da Escola de Medicina de Harvard por consultas sobre técnica estéril, bem-estar animal e os materiais utilizados para desenvolver este protocolo.
Materials
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
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