Fractura transversal del fémur del ratón con pasador estabilizador
Summary
Este protocolo describe un método para realizar fracturas en ratones adultos y monitorear el proceso de curación.
Abstract
La reparación de fracturas es una función esencial del esqueleto que no se puede modelar de manera confiable in vitro. Un modelo de lesión de ratón es un enfoque eficiente para probar si un gen, producto genético o medicamento influye en la reparación ósea porque los huesos murinos recapitulan las etapas observadas durante la curación de fracturas humanas. Cuando un ratón o un humano rompe un hueso, se inicia una respuesta inflamatoria y el periostio, un nicho de células madre que rodea el hueso en sí, se activa y se expande. Las células que residen en el periostio se diferencian para formar un callo blando vascularizado. La transición del callo blando a un callo duro ocurre a medida que las células progenitoras esqueléticas reclutadas se diferencian en células mineralizantes, y el puente de los extremos fracturados resulta en la unión ósea. El callo mineralizado luego se somete a una remodelación para restaurar la forma y estructura originales del hueso curado. La curación de fracturas se ha estudiado en ratones utilizando varios modelos de lesiones. Aún así, la mejor manera de recapitular todo este proceso biológico es romper la sección transversal de un hueso largo que abarca ambas cortezas. Este protocolo describe cómo se puede realizar de forma segura una fractura de fémur transversal estabilizada para evaluar la curación en ratones adultos. También se proporciona un protocolo quirúrgico que incluye técnicas detalladas de recolección e imágenes para caracterizar las diferentes etapas de la curación de fracturas.
Introduction
Las fracturas, roturas en la continuidad de la superficie ósea, ocurren en todos los segmentos de la población. Se vuelven graves en personas que tienen huesos frágiles debido al envejecimiento o la enfermedad, y se espera que los costos de atención médica de las fracturas por fragilidad superen los $ 25 mil millones en 5 años 1,2,3,4,5. Comprender los mecanismos biológicos involucrados en la reparación de fracturas sería un punto de partida en el desarrollo de nuevas terapias destinadas a mejorar el proceso de curación. Investigaciones anteriores han demostrado que, tras la fractura, se producen cuatro pasos significativos que permiten que el hueso sane: (1) formación del hematoma; (2) formación de un callo fibrocartilaginoso; (3) mineralización del callo blando para formar hueso; y (4) remodelación del hueso curado 6,7. Muchos procesos biológicos se activan para curar la fractura con éxito. En primer lugar, se inicia una respuesta proinflamatoria aguda inmediatamente después de una fractura 6,7. Luego, el periostio se activa y se expande, y las células periósticas se diferencian en condrocitos para formar un callo de cartílago que crece para llenar el espacio dejado por los segmentos óseos interrumpidos 6,7,8,9. Las células neurales y vasculares invaden el callo recién formado para proporcionar células adicionales y moléculas de señalización necesarias para facilitar la reparación 6,7,8,9,10. Además de contribuir a la formación de callos, las células periósticas también se diferencian en osteoblastos que depositan hueso tejido en el callo puente. Finalmente, los osteoclastos remodelan el hueso recién formado para volver a su forma original y estructura lamelar 7,8,9,10,11. Muchos grupos desarrollaron modelos de ratón de reparación de fracturas. Uno de los modelos de fractura más tempranos y más utilizados en ratones es el enfoque Einhorn, donde se deja caer un peso sobre la pierna desde una altura específica12. La falta de control sobre el ángulo y la fuerza aplicada para inducir la fractura crea mucha variabilidad en la ubicación y el tamaño de la discontinuidad ósea. Posteriormente, da lugar a variaciones en la respuesta específica de curación de fracturas observada. Otros enfoques populares son la intervención quirúrgica para producir un defecto monocortical tibial o fracturas por estrés, procedimientos que inducen respuestas de curación comparativamente más leves10,13. La variabilidad en estos modelos se debe principalmente a la persona que realiza el procedimiento14.
Aquí, un modelo detallado de lesión de fémur de ratón permite el control sobre la rotura para proporcionar una lesión reproducible y permitir una evaluación cuantitativa y cualitativa de la reparación de la fractura de fémur. Específicamente, se introduce un avance completo en los fémures de ratones adultos y estabiliza los extremos de la fractura para dar cuenta del papel que desempeña la carga física en la curación ósea. También se proporcionan en detalle los métodos para recolectar tejidos e imágenes de los diferentes pasos del proceso de curación utilizando histología y tomografía microinformática (microCT).
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de lesión detallado en este protocolo abarca los cuatro pasos significativos observados durante la curación de fracturas espontáneas, incluyendo (1) respuesta proinflamatoria con la formación del hematoma, (2) reclutamiento de progenitores esqueléticos del periostio para formar el callo blando, (3) mineralización del callo por osteoblastos y (4) remodelación del hueso por osteoclastos.
El procedimiento quirúrgico descrito en este manuscrito está optimizado para ratones adult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Vicki Rosen por el apoyo financiero y la orientación con el proyecto. También nos gustaría agradecer al personal veterinario y de IACUC en la Escuela de Medicina de Harvard por la consulta sobre la técnica estéril, el bienestar animal y los materiales utilizados para desarrollar este protocolo.
Materials
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
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