Quantifizierung vaskulärer Parameter in der gesamten Netzhaut von Mäusen mit nicht-proliferativen und proliferativen Retinopathien
Summary
Dieser Artikel beschreibt einen gut etablierten und reproduzierbaren Lektin-Färbungsassay für die gesamten Netzhautpräparate und die Protokolle, die für die quantitative Messung von Gefäßparametern erforderlich sind, die bei proliferativen und nicht-proliferativen Retinopathien häufig verändert sind.
Abstract
Retinopathien sind eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die das neurosensorische Gewebe des Auges betreffen. Sie sind gekennzeichnet durch Neurodegeneration, Gliose und eine fortschreitende Veränderung der Gefäßfunktion und -struktur. Obwohl der Beginn der Retinopathien durch subtile Störungen der visuellen Wahrnehmung gekennzeichnet ist, sind die Veränderungen im Gefäßplexus die ersten Anzeichen, die von Klinikern festgestellt werden. Das Fehlen oder Vorhandensein einer Neovaskularisation bestimmt, ob die Retinopathie entweder als nicht-proliferativ (NPDR) oder proliferativ (PDR) klassifiziert wird. In diesem Sinne versuchten mehrere Tiermodelle, spezifische vaskuläre Merkmale jedes Stadiums nachzuahmen, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu bestimmen, die an Endothelveränderungen, neuronalem Tod und anderen Ereignissen in der Netzhaut beteiligt sind. In diesem Artikel werden wir eine vollständige Beschreibung der Verfahren bereitstellen, die für die Messung der retinalen vaskulären Parameter bei Erwachsenen und Frühgeburtsmäusen am postnatalen Tag (P) 17 erforderlich sind. Wir werden die Protokolle zur Durchführung der retinalen Gefäßfärbung mit Isolectin GSA-IB4 in ganzen Halterungen für die spätere mikroskopische Visualisierung detailliert beschreiben. Wichtige Schritte für die Bildverarbeitung mit der Software Image J Fiji werden ebenfalls bereitgestellt, daher können die Leser Gefäßdichte, Durchmesser und Tortuosität, vaskuläre Verzweigung sowie avaskuläre und neovaskuläre Bereiche messen. Diese Werkzeuge sind sehr hilfreich, um vaskuläre Veränderungen sowohl bei nicht-proliferativen als auch bei proliferativen Retinopathien zu bewerten und zu quantifizieren.
Introduction
Die Augen werden von zwei arterio-venösen Systemen genährt: dem choroidalen Gefäßsystem, einem externen vaskulären Netzwerk, das retinales pigmentiertes Epithel und Photorezeptoren bewässert; und das neuroretinale Gefäßsystem, das die Ganglienzellschicht und die innere Kernschicht der Netzhaut bewässert1. Das retinale Gefäßsystem ist ein organisiertes Netzwerk von Gefäßen, die Nährstoffe und Sauerstoff an die Netzhautzellen liefern und Abfallprodukte ernten, um eine ordnungsgemäße visuelle Signalübertragung zu gewährleisten. Dieses Gefäßsystem weist einige Besonderheiten auf, darunter: das Fehlen einer autonomen Innervation, die Regulierung des Gefäßtonus durch intrinsische Netzhautmechanismen und den Besitz einer komplexen Netzhaut-Blut-Schranke2. Daher stand das retinale Gefäßsystem im Mittelpunkt vieler Forscher, die nicht nur die Vaskulogenese während der Entwicklung, sondern auch die Veränderungen und die pathologische Angiogenese, die diese Gefäße bei Krankheiten durchlaufen, umfassend untersucht haben3. Die häufigsten vaskulären Veränderungen, die bei Retinopathien beobachtet werden, sind Gefäßdilatation, Neovaskularisation, Verlust der vaskulären Arborisierung und Deformation der netzhautlichen Hauptgefäße, was sie zickzaggiger macht4,5,6. Eine oder mehrere der beschriebenen Veränderungen sind die frühesten Anzeichen, die von Ärzten erkannt werden können. Die vaskuläre Visualisierung bietet eine schnelle, nicht-invasive und kostengünstige Screening-Methode7. Die umfangreiche Untersuchung der im Gefäßbaum beobachteten Veränderungen wird bestimmen, ob die Retinopathie nicht proliferativ oder proliferativ ist und die weitere Behandlung. Die nicht-proliferativen Retinopathien können sich unter anderem mit abweichender vaskulärer Morphologie, verminderter Gefäßdichte, azellulären Kapillaren, Perizytentod, Makulaödemen manifestieren. Darüber hinaus entwickeln proliferative Retinopathien auch eine erhöhte vaskuläre Permeabilität, extrazelluläres Remodeling und die Bildung von vaskulären Büscheln in Richtung der Glaskörperhöhle, die leicht abbauen oder eine Netzhautablösung induzieren8.
Einmal erkannt, kann die Retinopathie durch ihre Gefäßveränderungen überwacht werden9,10. Das Fortschreiten der Pathologie kann durch die strukturellen Veränderungen der Gefäße verfolgt werden, die die Stadien der Krankheit klar definieren11. Die Quantifizierung von Gefäßveränderungen in diesen Modellen ermöglichte es, Gefäßveränderungen und neuronalen Tod zu korrelieren und pharmakologische Therapien für Patienten in verschiedenen Phasen der Krankheit zu testen.
Im Lichte der obigen Aussagen sind wir der Ansicht, dass die Erkennung und Quantifizierung von Gefäßveränderungen in Retinopathiestudien von grundlegender Bedeutung ist. In dieser Arbeit werden wir zeigen, wie man verschiedene vaskuläre Parameter misst. Dazu werden wir zwei Tiermodelle einsetzen. Eines davon ist das Sauerstoff-induzierte Retinopathie-Mausmodell12, das die Retinopathie der Frühgeburtlichkeit und einige Aspekte der proliferativen diabetischen Retinopathie nachahmt13,14. In diesem Modell werden wir avaskuläre Bereiche, neovaskuläre Bereiche und die Dilatation und Tortuosität der Hauptgefäße messen. In unserem Labor wurde ein Mausmodell für das Metabolische Syndrom (MetS) entwickelt, das eine nicht-proliferative Retinopathie induziert15. Hier werden wir die Gefäßdichte und Verzweigung bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tiermodelle von Retinopathien sind leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der Gefäßentwicklung, des Remodelings oder der pathologischen Angiogenese. Der Erfolg dieser Studien auf diesem Gebiet beruht auf dem einfachen Zugang zum Gewebe, der es ermöglicht, eine Vielzahl von Techniken durchzuführen und Daten von In-vivo- und postmortalen Mäusen zu liefern26,27. Darüber hinaus wurde eine große Korrelation zwischen In-vivo-Studien</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Carlos Mas, María Pilar Crespo und Cecilia Sampedro von CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinien) für die Unterstützung in der konfokalen Mikroskopie, Soledad Miró und Victoria Blanco für die engagierte Tierpflege und Laura Gatica für die histologische Unterstützung. Wir danken auch Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication of FCQ) für die Videoproduktion und -edition und Paul Hobson für seine kritische Lektüre und sprachliche Überarbeitung des Manuskripts.
Dieser Artikel wurde durch Stipendien von Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle an M.C.S.) finanziert.
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
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