Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Summary

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Abstract

Retinopatias são um grupo heterogêneo de doenças que afetam o tecido neurossensorial do olho. Caracterizam-se pela neurodegeneração, gliose e uma mudança progressiva na função e estrutura vascular. Embora o início das retinopatias seja caracterizado por distúrbios sutis na percepção visual, as modificações no plexo vascular são os primeiros sinais detectados pelos médicos. A ausência ou presença de neovascularização determina se a retinopatia é classificada como não proliferativa (NPDR) ou proliferativa (PDR). Nesse sentido, vários modelos animais tentaram imitar características vasculares específicas de cada estágio para determinar os mecanismos subjacentes envolvidos em alterações de endotélio, morte neuronal e outros eventos que ocorrem na retina. Neste artigo, forneceremos uma descrição completa dos procedimentos necessários para a medição dos parâmetros vasculares da retina em adultos e camundongos de nascimento precoce no dia do pós-natal (P)17. Detalharemos os protocolos para a realização de coloração vascular de retina com Isolectina GSA-IB4 em montagens inteiras para visualização microscópica posterior. As principais etapas para o processamento de imagens com o software Image J Fiji também são fornecidas, portanto, os leitores poderão medir a densidade, diâmetro e tortuosidade do vaso, ramificações vasculares, bem como áreas avasculares e neovasculares. Essas ferramentas são altamente úteis para avaliar e quantificar alterações vasculares em retinopatias não proliferativas e proliferativas.

Introduction

Os olhos são nutridos por dois sistemas arterio-venosos: a vasculatura choroidal, uma rede vascular externa que irriga epitélio pigmentado da retina e fotorreceptores; e a vasculatura neuro-retina que irrigam a camada de células gânglios e a camada nuclear interna da ^retina1. A vasculatura da retina é uma rede organizada de vasos que fornecem nutrientes e oxigênio para as células da retina e colhem resíduos para garantir a transdução adequada da sinalização visual. Esta vasculatura tem algumas características distintas, incluindo: a falta de inervação autônoma, a regulação do tom vascular por mecanismos intrínsecos de retina e a posse de uma complexa barreira retina-sangue2. Portanto, a vasculatura da retina tem sido o foco de muitos pesquisadores que estudaram extensivamente não só a vasculogênese durante o desenvolvimento, mas também as alterações e a angiogênese patológica que esses vasos sofrem em ^doenças3. As alterações vasculares mais comuns observadas nas retinopatias são dilatação de vasos, neovascularização, perda de arborização vascular e deformação dos vasos principais da retina, o que os torna mais ziggaggy4,5,6. Uma ou mais das alterações descritas são os primeiros sinais a serem detectados pelos médicos. A visualização vascular fornece um método de triagem rápido, não invasivo e ^barato7. O extenso estudo das alterações observadas na árvore vascular determinará se a retinopatia não é proliferativa ou proliferativa e o tratamento posterior. As retinopatias não proliferativas podem manifestar-se com morfologia vascular aberrante, diminuição da densidade vascular, capilares acelulares, pericítes de morte, edema macular, entre outros. Além disso, as retinopatias proliferativas também desenvolvem maior permeabilidade vascular, remodelagem extracelular e formação de tufos vasculares em direção à cavidade vítrea que facilmente quebra ou induz o descolamento da ^retina8.

Uma vez detectada, a retinopatia pode ser monitorada através de suas alterações ^{vasculares9,10}. A progressão da patologia pode ser acompanhada pelas mudanças estruturais dos vasos, que definem claramente os estágios da ^doença11. A quantificação de alterações vasculares nesses modelos permitiu correlacionar alterações de vasos e morte neuronal e testar terapias farmacológicas para pacientes em diferentes fases da doença.

À luz das afirmações acima, consideramos que o reconhecimento e quantificação das alterações vasculares são fundamentais nos estudos de retinopatias. Neste trabalho, mostraremos como medir diferentes parâmetros vasculares. Para isso, empregaremos dois modelos animais. Um deles é o modelo de retinopatia induzido pelo ^oxigênio12, que imita a Retinopatia da Prematuridade e alguns aspectos da Retinopatia Diabética ^{Proliferativa13,14}. Neste modelo, mediremos áreas avasculares, áreas neovasculares e a dilatação e tortuosidade dos principais vasos. Em nosso laboratório, foi desenvolvido um modelo de camundongos da Síndrome Metabólica (MetS), que induz uma retinopatia não ^{proliferativa15}. Aqui, vamos avaliar a densidade vascular e ramificações.

Protocol

Os camundongos C57BL/6J foram manuseados de acordo com as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão. Os procedimentos experimentais foram desenhados e aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (CICUAL) da Faculdade de Ciências Químicas da Universidade Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18). 1. Preparação de soluções tampão e reagentes Preparação de 1x salina tampão fosfato (PBS): Adi…

Representative Results

Como descrito na seção de protocolo, a partir de um único ensaio de coloração fluorescente você pode obter a morfologia vascular e avaliar vários parâmetros de interesse quantitativamente. A busca de uma alteração específica dependerá do tipo de retinopatia estudada. Neste artigo, áreas avasculares e neovasculares, tortuosidade e dilatação foram avaliadas em um modelo de rato de retinopatia proliferativa, enquanto o ramificação vascular e a densidade foram analisados em um modelo de camundongos MetS, o q…

Discussion

Modelos animais de retinopatias são ferramentas poderosas para estudar o desenvolvimento vascular, remodelação ou angiogênese patológica. O sucesso desses estudos no campo conta com o fácil acesso ao tecido que permite realizar uma ampla variedade de técnicas, fornecendo dados de camundongos in vivo e pós-morte26,27. Além disso, grande correlação tem sido encontrada entre estudos in vivo e análises clínicas, proporcionando …

Materials

Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis