Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas
Summary
Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.
Abstract
Las retinopatías son un grupo heterogéneo de enfermedades que afectan al tejido neurosensorial del ojo. Se caracterizan por neurodegeneración, gliosis y un cambio progresivo en la función y estructura vascular. Aunque el inicio de las retinopatías se caracteriza por alteraciones sutiles en la percepción visual, las modificaciones en el plexo vascular son los primeros signos detectados por los médicos. La ausencia o presencia de neovascularización determina si la retinopatía se clasifica como no proliferativa (NPDR) o proliferativa (PDR). En este sentido, varios modelos animales intentaron imitar características vasculares específicas de cada etapa para determinar los mecanismos subyacentes involucrados en las alteraciones del endotelio, la muerte neuronal y otros eventos que tienen lugar en la retina. En este artículo, proporcionaremos una descripción completa de los procedimientos necesarios para la medición de los parámetros vasculares de la retina en adultos y ratones de nacimiento prematuro en el día postnatal (P)17. Detallaremos los protocolos para llevar a cabo la tinción vascular retiniana con Isolectina GSA-IB4 en monturas enteras para su posterior visualización microscópica. También se proporcionan pasos clave para el procesamiento de imágenes con el software Image J Fiji, por lo tanto, los lectores podrán medir la densidad de los vasos, el diámetro y la tortuosidad, la ramificación vascular, así como las áreas avasculares y neovasculares. Estas herramientas son de gran ayuda para evaluar y cuantificar las alteraciones vasculares tanto en las retinopatías no proliferativas como en las proliferativas.
Introduction
Los ojos se nutren de dos sistemas arterio-venosos: la vasculatura coroidea, una red vascular externa que riega el epitelio pigmentado de la retina y los fotorreceptores; y la vasculatura neurorretiniana que irriga la capa de células ganglionares y la capa nuclear interna de la retina1. La vasculatura retiniana es una red organizada de vasos que suministran nutrientes y oxígeno a las células de la retina y cosechan productos de desecho para garantizar la transducción adecuada de la señalización visual. Esta vasculatura tiene algunas características distintivas, entre ellas: la falta de inervación autónoma, la regulación del tono vascular por mecanismos retinianos intrínsecos y la posesión de una compleja barrera retiniano-sanguínea2. Por ello, la vasculatura retiniana ha sido el foco de muchos investigadores que han estudiado ampliamente no solo la vasculogénesis durante el desarrollo, sino también las alteraciones y la angiogénesis patológica que sufren estos vasos en las enfermedades3. Los cambios vasculares más frecuentes observados en las retinopatías son la dilatación de los vasos, la neovascularización, la pérdida de arborización vascular y la deformación de los vasos principales de la retina, lo que los hace más ziggaggy4,5,6. Una o más de las alteraciones descritas son los primeros signos detectados por los médicos. La visualización vascular proporciona un método de detección rápido, no invasivo y económico7. El estudio exhaustivo de las alteraciones observadas en el árbol vascular determinará si la retinopatía es no proliferativa o proliferativa y el tratamiento posterior. Las retinopatías no proliferativas pueden manifestarse con morfología vascular aberrante, disminución de la densidad vascular, capilares acelulares, muerte de pericitos, edema macular, entre otros. Además, las retinopatías proliferativas también desarrollan una mayor permeabilidad vascular, remodelación extracelular y la formación de mechones vasculares hacia la cavidad vítrea que se descomponen o inducen fácilmente el desprendimiento de retina8.
Una vez detectada, la retinopatía puede ser monitorizada a través de sus cambios vasculares9,10. La progresión de la patología se puede seguir a través de los cambios estructurales de los vasos, que definen claramente las etapas de la enfermedad11. La cuantificación de las alteraciones vasculares en estos modelos permitió correlacionar los cambios de vasos y la muerte neuronal y probar terapias farmacológicas para pacientes en diferentes fases de la enfermedad.
A la luz de las afirmaciones anteriores, consideramos que el reconocimiento y cuantificación de las alteraciones vasculares son fundamentales en los estudios de retinopatías. En este trabajo, mostraremos cómo medir diferentes parámetros vasculares. Para ello, emplearemos dos modelos animales. Uno de ellos es el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno12, que imita la retinopatía del prematuro y algunos aspectos de la retinopatía diabética proliferativa13,14. En este modelo, mediremos las áreas avasculares, las áreas neovasculares y la dilatación y tortuosidad de los vasos principales. En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo de ratón con Síndrome Metabólico (SM), que induce una retinopatía no proliferativa15. Aquí, evaluaremos la densidad vascular y la ramificación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los modelos animales de retinopatías son herramientas poderosas para estudiar el desarrollo vascular, la remodelación o la angiogénesis patológica. El éxito de estos estudios en el campo se basa en el fácil acceso al tejido que permite realizar una amplia variedad de técnicas, aportando datos de ratones in vivo y postmortem26,27. Además, se ha encontrado una gran correlación entre los estudios in vivo y los análisis clínicos,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Carlos Mas, María Pilar Crespo y Cecilia Sampedro de CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) por su asistencia en microscopía confocal, a Soledad Miró y Victoria Blanco por el cuidado dedicado a los animales y a Laura Gatica por la asistencia histológica. También agradecemos a Víctor Díaz (Pro-Secretario de Comunicación Institucional de la FCQ) por la producción y edición del video y a Paul Hobson por su lectura crítica y revisión lingüística del manuscrito.
Este artículo fue financiado por subvenciones de la Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (todos a M.C.S.).
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
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