القياس الكمي للمعلمات الوعائية في شبكية العين الكاملة للفئران ذات اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري
Summary
تصف هذه المقالة فحص بقع اللكتين الراسخ والقابل للتكرار لمستحضرات الشبكية الكاملة والبروتوكولات المطلوبة للقياس الكمي لمعلمات الأوعية الدموية التي يتم تغييرها بشكل متكرر في اعتلال الشبكية التكاثري وغير التكاثري.
Abstract
اعتلال الشبكية هي مجموعة غير متجانسة من الأمراض التي تؤثر على الأنسجة العصبية الحسية للعين. وهي تتميز بالتنكس العصبي والدبقية والتغيير التدريجي في وظيفة الأوعية الدموية وبنيتها. على الرغم من أن بداية اعتلال الشبكية تتميز باضطرابات طفيفة في الإدراك البصري ، إلا أن التعديلات في الضفيرة الوعائية هي العلامات الأولى التي يكتشفها الأطباء. يحدد غياب أو وجود الأوعية الدموية الجديدة ما إذا كان اعتلال الشبكية يصنف على أنه إما غير تكاثري (NPDR) أو تكاثري (PDR). وبهذا المعنى ، حاولت العديد من النماذج الحيوانية محاكاة ميزات الأوعية الدموية المحددة لكل مرحلة لتحديد الآليات الأساسية التي تنطوي عليها تغيرات البطانة ، والموت العصبي وغيرها من الأحداث التي تحدث في شبكية العين. في هذه المقالة ، سنقدم وصفا كاملا للإجراءات المطلوبة لقياس معلمات الأوعية الدموية في شبكية العين لدى البالغين والفئران المبكرة الولادة في يوم ما بعد الولادة (P)17. سنقوم بتفصيل البروتوكولات اللازمة لتنفيذ تلطيخ الأوعية الدموية في الشبكية باستخدام Isolectin GSA-IB4 في حوامل كاملة للتصور المجهري اللاحق. كما يتم توفير الخطوات الرئيسية لمعالجة الصور باستخدام برنامج Image J Fiji ، وبالتالي ، سيتمكن القراء من قياس كثافة الأوعية الدموية وقطرها وتعرجها ، وتفرع الأوعية الدموية ، وكذلك المناطق الوعائية والأوعية الدموية الجديدة. هذه الأدوات مفيدة للغاية لتقييم وقياس التغيرات الوعائية في كل من اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري.
Introduction
تتغذى العينان على نظامين شريانيين وريديين: الأوعية الدموية المشيمية ، وهي شبكة أوعية دموية خارجية تروي الظهارة المصطبغة للشبكية والمستقبلات الضوئية. والأوعية الدموية العصبية الشبكية التي تروي طبقة الخلايا العقدية والطبقة النووية الداخلية للشبكية1. الأوعية الدموية الشبكية هي شبكة منظمة من الأوعية التي توصل العناصر الغذائية والأكسجين إلى خلايا الشبكية وتحصد النفايات لضمان نقل الإشارات البصرية المناسبة. هذا الأوعية الدموية له بعض السمات المميزة، بما في ذلك: عدم وجود تعصيب مستقل، وتنظيم لهجة الأوعية الدموية من خلال آليات الشبكية الجوهرية وامتلاك حاجز معقد بين الشبكية والدم2. لذلك ، كانت الأوعية الدموية في شبكية العين محور تركيز العديد من الباحثين الذين درسوا على نطاق واسع ليس فقط تكوين الأوعية الدموية أثناء التطور ، ولكن أيضا التغيرات وتكوين الأوعية المرضية التي تخضع لها هذه الأوعية في الأمراض3. التغيرات الوعائية الأكثر شيوعا التي لوحظت في اعتلال الشبكية هي توسع الأوعية الدموية ، والأوعية الدموية الجديدة ، وفقدان تشجير الأوعية الدموية وتشوه الأوعية الرئيسية في شبكية العين ، مما يجعلها أكثر تعرجا4،5،6. واحد أو أكثر من التعديلات الموصوفة هي أقدم العلامات التي يتم اكتشافها من قبل الأطباء. يوفر التصور الوعائي طريقة فحص سريعة وغير جراحية وغير مكلفة7. ستحدد الدراسة المكثفة للتغيرات التي لوحظت في شجرة الأوعية الدموية ما إذا كان اعتلال الشبكية غير تكاثري أو تكاثري والعلاج الإضافي. يمكن أن تظهر اعتلالات الشبكية غير التكاثرية نفسها مع مورفولوجيا الأوعية الدموية الشاذة ، وانخفاض كثافة الأوعية الدموية ، والشعيرات الدموية اللاخلوية ، وموت الخلايا المحيطة ، والوذمة البقعية ، من بين أمور أخرى. بالإضافة إلى ذلك، تؤدي اعتلالات الشبكية التكاثرية أيضا إلى زيادة نفاذية الأوعية الدموية، وإعادة التشكيل خارج الخلية، وتشكيل خصلات الأوعية الدموية نحو التجويف الزجاجي الذي ينهار بسهولة أو يحفز انفصال الشبكية8.
بمجرد اكتشافه ، يمكن مراقبة اعتلال الشبكية من خلال تغييراته الوعائية9,10. يمكن متابعة تطور علم الأمراض من خلال التغييرات الهيكلية للأوعية ، والتي تحدد بوضوح مراحل المرض11. سمح القياس الكمي للتغيرات الوعائية في هذه النماذج بالربط بين تغيرات الأوعية الدموية والموت العصبي واختبار العلاجات الدوائية للمرضى في مراحل مختلفة من المرض.
في ضوء العبارات المذكورة أعلاه ، نعتبر أن التعرف على التغيرات الوعائية وتحديدها كميا أمر أساسي في دراسات اعتلال الشبكية. في هذا العمل ، سنوضح كيفية قياس معلمات الأوعية الدموية المختلفة. للقيام بذلك ، سنستخدم نموذجين حيوانيين. واحد منهم هو نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين12 ، الذي يحاكي اعتلال الشبكية الخداجي وبعض جوانب اعتلال الشبكية السكري التكاثري13,14. في هذا النموذج ، سنقيس المناطق اللاوعائية ومناطق الأوعية الدموية الجديدة وتوسع الأوعية الرئيسية وتعرجها. في مختبرنا ، تم تطوير نموذج فأر متلازمة التمثيل الغذائي (MetS) ، والذي يحفز اعتلال الشبكية غير التكاثري15. هنا ، سنقوم بتقييم كثافة الأوعية الدموية والتفرع.
Protocol
Representative Results
Discussion
النماذج الحيوانية لاعتلال الشبكية هي أدوات قوية لدراسة تطور الأوعية الدموية أو إعادة تشكيلها أو تكوين الأوعية الدموية المرضية. يعتمد نجاح هذه الدراسات في هذا المجال على سهولة الوصول إلى الأنسجة التي تسمح بإجراء مجموعة واسعة من التقنيات ، مما يوفر بيانات من الفئران في الجسم الحي وبع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر كارلوس ماس، وماريا بيلار كريسبو، وسيسيليا سامبيدرو من مركز ميكرو ونانوسكوبيا قرطبة، CONICET-UNC، قرطبة، الأرجنتين) على المساعدة في الفحص المجهري البؤري، وإلى سوليداد ميرو وفيكتوريا بلانكو على الرعاية المتفانية للحيوانات، وإلى لورا غاتيكا على المساعدة النسيجية. كما نشكر فيكتور دياز (السكرتير المؤيد للاتصال المؤسسي في FCQ) على إنتاج الفيديو وإصداره وبول هوبسون على قراءته النقدية ومراجعته اللغوية للمخطوطة.
تم تمويل هذه المقالة من خلال منح من أمانة العلوم والتكنولوجيا ، والجامعة الوطنية في قرطبة (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021 ، Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) ، Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (جميعها إلى M.C.S).
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O’Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
