Quantification des paramètres vasculaires dans les rétines montagnards entières de souris atteintes de rétinopathies non prolifératives et prolifératives
Summary
Cet article décrit un test de coloration à la lectine bien établi et reproductible pour l’ensemble des préparations rétiniennes de monture et les protocoles requis pour la mesure quantitative des paramètres vasculaires fréquemment modifiés dans les rétinopathies prolifératives et non prolifératives.
Abstract
Les rétinopathies sont un groupe hétérogène de maladies qui affectent le tissu neurosensoriel de l’œil. Ils sont caractérisés par une neurodégénérescence, une gliose et un changement progressif de la fonction et de la structure vasculaires. Bien que l’apparition des rétinopathies soit caractérisée par de subtiles perturbations de la perception visuelle, les modifications du plexus vasculaire sont les premiers signes détectés par les cliniciens. L’absence ou la présence de néovascularisation détermine si la rétinopathie est classée comme non proliférative (NPDR) ou proliférative (PDR). En ce sens, plusieurs modèles animaux ont tenté d’imiter des caractéristiques vasculaires spécifiques de chaque stade pour déterminer les mécanismes sous-jacents impliqués dans les altérations de l’endothélium, la mort neuronale et d’autres événements se produisant dans la rétine. Dans cet article, nous fournirons une description complète des procédures requises pour la mesure des paramètres vasculaires rétiniens chez les adultes et les souris de naissance précoce au jour postnatal (P) 17. Nous détaillerons les protocoles pour effectuer la coloration vasculaire rétinienne avec Isolectin GSA-IB4 dans des montures entières pour une visualisation microscopique ultérieure. Les étapes clés pour le traitement de l’image avec le logiciel Image J Fiji sont également fournies, par conséquent, les lecteurs seront en mesure de mesurer la densité des vaisseaux, le diamètre et la tortuosité, la ramification vasculaire, ainsi que les zones avasculaires et néovasculaires. Ces outils sont très utiles pour évaluer et quantifier les altérations vasculaires dans les rétinopathies non prolifératives et prolifératives.
Introduction
Les yeux sont nourris par deux systèmes artério-veineux : le système vasculaire choroïdien, un réseau vasculaire externe qui irrigue l’épithélium pigmenté rétinien et les photorécepteurs ; et le système vasculaire neuro-rétinien qui irrigue la couche des cellules ganglionnaires et la couche nucléaire interne de la rétine1. Le système vasculaire rétinien est un réseau organisé de vaisseaux qui fournissent des nutriments et de l’oxygène aux cellules rétiniennes et récoltent des déchets pour assurer une transduction de signalisation visuelle appropriée. Cette vascularisation présente des caractéristiques distinctes, notamment : l’absence d’innervation autonome, la régulation du tonus vasculaire par des mécanismes rétiniens intrinsèques et la possession d’une barrière sanguine rétinienne complexe2. Par conséquent, le système vasculaire rétinien a été au centre de nombreux chercheurs qui ont étudié de manière approfondie non seulement la vasculogenèse au cours du développement, mais aussi les altérations et l’angiogenèse pathologique que ces vaisseaux subissent dans les maladies3. Les changements vasculaires les plus courants observés dans les rétinopathies sont la dilatation des vaisseaux, la néovascularisation, la perte d’arborisation vasculaire et la déformation des vaisseaux principaux de la rétine, ce qui les rend plus ziggaggy4,5,6. Une ou plusieurs des altérations décrites sont les premiers signes détectés par les cliniciens. La visualisation vasculaire fournit une méthode de dépistage rapide, non invasive et peu coûteuse7. L’étude approfondie des altérations observées dans l’arbre vasculaire déterminera si la rétinopathie est non proliférative ou proliférative et le traitement ultérieur. Les rétinopathies non prolifératives peuvent se manifester par une morphologie vasculaire aberrante, une diminution de la densité vasculaire, des capillaires acellulaires, la mort des péricytes, un œdème maculaire, entre autres. En outre, les rétinopathies prolifératives développent également une perméabilité vasculaire accrue, un remodelage extracellulaire et la formation de touffes vasculaires vers la cavité vitréenne qui se décomposent facilement ou induisent un décollement de la rétine8.
Une fois détectée, la rétinopathie peut être surveillée par ses changements vasculaires9,10. La progression de la pathologie peut être suivie à travers les changements structurels des vaisseaux, qui définissent clairement les stades de la maladie11. La quantification des altérations vasculaires dans ces modèles a permis de corréler les changements vasculaires et la mort neuronale et de tester des thérapies pharmacologiques pour les patients dans différentes phases de la maladie.
À la lumière des déclarations ci-dessus, nous considérons que la reconnaissance et la quantification des altérations vasculaires sont fondamentales dans les études sur les rétinopathies. Dans ce travail, nous allons montrer comment mesurer différents paramètres vasculaires. Pour ce faire, nous utiliserons deux modèles animaux. L’un d’eux est le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène12, qui imite la rétinopathie de prématurité et certains aspects de la rétinopathie diabétique proliférative13,14. Dans ce modèle, nous mesurerons les zones avasculaires, les zones néovasculaires et la dilatation et la tortuosité des vaisseaux principaux. Dans notre laboratoire, un modèle murin de syndrome métabolique (MetS) a été développé, qui induit une rétinopathie non proliférative15. Ici, nous allons évaluer la densité vasculaire et la ramification.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les modèles animaux de rétinopathies sont des outils puissants pour étudier le développement vasculaire, le remodelage ou l’angiogenèse pathologique. Le succès de ces études sur le terrain repose sur la facilité d’accès au tissu qui permet d’effectuer une grande variété de techniques, fournissant des données provenant de souris in vivo et post-mortem26,27. De plus, une grande corrélation a été trouvée entre les études …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Carlos Mas, María Pilar Crespo et Cecilia Sampedro du CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentine) pour leur assistance en microscopie confocale, Soledad Miró et Victoria Blanco pour les soins dédiés aux animaux et Laura Gatica pour l’assistance histologique. Nous remercions également Victor Diaz (Pro-Secrétaire à la Communication Institutionnelle de la FCQ) pour la production et l’édition vidéo et Paul Hobson pour sa lecture critique et sa révision linguistique du manuscrit.
Cet article a été financé par des subventions de Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (tous à M.C.S.).
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
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