Proliferatif Olmayan ve Proliferatif Retinopatilerle Farelerin Tüm Mount Retinalarında Vasküler Parametrelerin Nicelemesi
Summary
Bu makalede, tüm mount retinal preparatları için iyi kurulmuş ve tekrarlanabilir bir lektin lekesi testi ve proliferatif ve proliferatif olmayan retinopatilerde sıklıkla değiştirilen vasküler parametrelerin nicel ölçümü için gerekli protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Retinopatiler, gözün nörosensör dokusunu etkileyen heterojen bir hastalık grubudur. Nörodejenerasyon, glioz ve vasküler fonksiyon ve yapıda ilerleyici bir değişiklik ile karakterizedirler. Retinopatilerin başlangıcı görsel algıda ince bozukluklarla karakterize edilse de, vasküler pleksustaki değişiklikler klinisyenler tarafından tespit edilen ilk belirtilerdir. Neovaskülarizasyonun yokluğu veya varlığı, retinopatinin proliferatif olmayan (NPDR) veya proliferatif (PDR) olarak sınıflandırılıp sınıflandırılmadığını belirler. Bu anlamda, birkaç hayvan modeli endotel değişiklikleri, nöronal ölüm ve retinada meydana gelen diğer olaylarda yer alan alttaki mekanizmaları belirlemek için her aşamanın spesifik vasküler özelliklerini taklit etmeye çalıştı. Bu yazıda, doğum sonrası (P)17’de yetişkinlerde ve erken doğum farelerinde retinal vasküler parametrelerin ölçümü için gerekli prosedürlerin tam bir açıklamasını sunacağız. Daha sonra mikroskobik görselleştirme için tüm montajlarda Isolectin GSA-IB4 ile retinal vasküler boyama yapmak için protokolleri detaylandıracağız. Image J Fiji yazılımı ile görüntü işleme için önemli adımlar da sağlanmaktadır, bu nedenle okuyucular damar yoğunluğunu, çapını ve tortusitesini, damar dallanmasını ve ayrıca avasküler ve neovasküler alanları ölçebilecektir. Bu araçlar hem proliferatif olmayan hem de proliferatif retinopatilerdeki vasküler değişiklikleri değerlendirmek ve ölçmek için son derece faydalıdır.
Introduction
Gözler iki arterio-venöz sistem tarafından beslenir: koroidal vaskülat, retina pigmentli epitel ve fotoreceptörleri sulayan harici bir damar ağı; ve ganglion hücreleri tabakasını ve retinanın iç nükleer tabakasını sulayan nöro-retinal vaskülat1. Retina vaskülatürü, uygun görsel sinyal transdüksiyonunun sağlanması için retina hücrelerine besin ve oksijen sağlayan ve atık ürünleri toplayan organize bir damar ağıdır. Bu vaskülatın bazı belirgin özellikleri vardır: otonom innervasyon eksikliği, damar tonunun içsel retina mekanizmaları tarafından düzenlenmesi ve karmaşık bir retinal-kan bariyerine sahip olması2. Bu nedenle, retinal vaskültür, gelişim sırasında sadece vaskülogenez değil, aynı zamanda bu damarların hastalıklarda geçirdiği değişiklikler ve patolojik anjiogenez üzerinde kapsamlı bir şekilde çalışmış birçok araştırmacının odak noktası olmuştur3. Retinopatilerde en sık gözlenen damar değişiklikleri damar genişlemesi, neovaskülarizasyon, damar arborizasyonu kaybı ve retina ana damarlarının deformasyonudur, bu da onları daha ziggaggy4,5,6 yapar. Açıklanan değişikliklerden biri veya daha fazlası klinisyenler tarafından tespit edilen en erken belirtilerdir. Vasküler görselleştirme hızlı, invaziv olmayan ve ucuz bir tarama yöntemi sağlar7. Vasküler ağaçta gözlenen değişikliklerin kapsamlı çalışması, retinopatinin proliferatif veya proliferatif olup olmadığını ve daha sonraki tedaviyi belirleyecektir. Proliferatif olmayan retinopatiler, diğerlerinin yanı sıra anormal vasküler morfoloji, azalmış vasküler yoğunluk, hücresel kılcal damarlar, perisit ölümü, makula ödemi ile kendini gösterebilir. Ek olarak, proliferatif retinopatiler ayrıca retina dekolmanını kolayca parçalayan veya indükleyen vitreus boşluğuna doğru artan vasküler geçirgenlik, hücre dışı yeniden şekillendirme ve vasküler tutamların oluşumunu geliştirir8.
Saptandıktan sonra, retinopati vasküler değişiklikleri ile izlenebilir9,10. Patolojinin ilerlemesi, hastalığın aşamalarını açıkça tanımlayan damarların yapısal değişiklikleri ile takip edilebilir11. Bu modellerdeki vasküler değişikliklerin nicelemesi, damar değişiklikleri ve nöronal ölümün korelasyona girmesine ve hastalığın farklı evrelerindeki hastalar için farmakolojik tedavilerin test edilmesine izin verdi.
Yukarıdaki ifadeler ışığında, retinopati çalışmalarında vasküler değişikliklerin tanınması ve nicelleştirilmesinin temel olduğunu düşünüyoruz. Bu çalışmada, farklı vasküler parametrelerin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bunu yapmak için iki hayvan modeli istihdam edeceğiz. Bunlardan biri, Prematürite Retinopatisini ve proliferatif Diyabetik Retinopatinin bazı yönlerini taklit eden Oksijen kaynaklı retinopati fare modeli12’dir13,14. Bu modelde, avasküler alanları, neovasküler alanları ve ana damarların genişlemesini ve işkencesini ölçeceğiz. Laboratuvarımızda, proliferatif olmayan bir retinopatiye neden olan metabolik sendrom (MetS) fare modeli geliştirilmiştir15. Burada damar yoğunluğunu ve dallanmayı değerlendireceğiz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retinopatilerin hayvan modelleri vasküler gelişim, tadilat veya patolojik anjiogenez çalışmak için güçlü araçlardır. Bu çalışmaların sahadaki başarısı, in vivo ve ölüm sonrası farelerden veri sağlayan çok çeşitli tekniklerin gerçekleştirildiğini sağlayan dokuya kolay erişime dayanır26,27. Ayrıca, in vivo çalışmalar ve klinik analiz arasında, bu modellere katı izlenebilirlik ve güvenilirlik sağlayan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ceminco’dan Carlos Mas, María Pilar Crespo ve Cecilia Sampedro’ya (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Arjantin) konfokal mikroskopi yardımı için, Soledad Miró ve Victoria Blanco’ya özel hayvan bakımı için ve Laura Gatica’ya histolojik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca video prodüksiyonu ve baskısı için Victor Diaz’a (FCQ Kurumsal İletişim Sekreteri) ve paul Hobson’a makalenin eleştirel okuma ve dil revizyonu için teşekkür ederiz.
Bu makale Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (hepsi M.C.S.’ye).
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O’Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
