Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.
Abstract
Zebrafischlarven besitzen bereits wenige Tage nach der Befruchtung ein voll funktionsfähiges Zentralnervensystem (ZNS) mit hoher Regenerationsfähigkeit. Dies macht dieses Tiermodell sehr nützlich für die Untersuchung von Rückenmarksverletzungen und Regeneration. Das Standardprotokoll zur Induktion solcher Läsionen besteht darin, den dorsalen Teil des Rumpfes manuell zu transektieren. Diese Technik erfordert jedoch ein umfangreiches Training und schädigt zusätzliches Gewebe. Es wurde ein Protokoll für laserinduzierte Läsionen entwickelt, um diese Einschränkungen zu umgehen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und Vollständigkeit der Rückenmarkstransektion bei vielen Tieren und zwischen verschiedenen Sitzungen ermöglicht, selbst für einen ungeschulten Bediener. Darüber hinaus sind Gewebeschäden hauptsächlich auf das Rückenmark selbst beschränkt, wodurch verwirrende Effekte durch die Verletzung verschiedener Gewebe, z. B. Haut, Muskeln und ZNS, verringert werden. Darüber hinaus sind Hemi-Läsionen des Rückenmarks möglich. Die verbesserte Erhaltung der Gewebeintegrität nach einer Laserverletzung erleichtert weitere Dissektionen, die für zusätzliche Analysen wie die Elektrophysiologie erforderlich sind. Daher bietet diese Methode eine präzise Kontrolle des Verletzungsausmaßes, die manuell nicht erreichbar ist. Dies ermöglicht neue experimentelle Paradigmen in diesem mächtigen Modell in der Zukunft.
Introduction
Im Gegensatz zu Säugetieren können Zebrafische (Danio rerio) nach einer Verletzung ihr zentrales Nervensystem (ZNS) reparieren1. Die Verwendung von Zebrafischlarven als Modell für die Rückenmarksregeneration ist relativ neu. Es hat sich als wertvoll erwiesen, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Reparatur zugrunde liegen2. Dies liegt an der einfachen Manipulation, dem kurzen Experimentierzyklus (jede Woche neue Larven), der optischen Transparenz des Gewebes und der geringen Größe der Larven, die sich ideal für die In-vivo-Fluoreszenzmikroskopie eignet.
Im Falle der Rückenmarksregeneration sind zwei weitere Vorteile der Verwendung von Larven die Geschwindigkeit der Genesung, einige Tage im Vergleich zu einigen Wochen für Erwachsene, und die Leichtigkeit, Verletzungen mit manuellen Techniken zu induzieren. Dies wurde in vielen Studien3,4,5, einschließlich neuerer Untersuchungen6,7, erfolgreich eingesetzt. Insgesamt führt dies zu einer erhöhten aussagekräftigen Datenproduktion, einer hohen Anpassungsfähigkeit experimenteller Protokolle und geringeren experimentellen Kosten. Die Verwendung von Larven, die jünger als 5 Tage nach der Befruchtung sind, reduziert auch den Einsatz von Tieren nach den 3R-Prinzipien in Tierversuchen8.
Nach einer Rückenmarksverletzung in Zebrafischlarven treten viele biologische Prozesse auf, darunter Entzündungsreaktion, Zellproliferation, Neurogenese, Migration überlebender oder neu erzeugter Zellen, Reformation funktioneller Axone und eine globale Umgestaltung neuronaler Prozessschaltkreise und Wirbelsäulengewebe6,7,9,10 . Um erfolgreich orchestriert zu werden, beinhalten diese Prozesse eine fein regulierte Interaktion zwischen einer Reihe von Zelltypen, extrazellulären Matrixkomponenten und biochemischen Signalen11,12. Die Entschlüsselung der Details dieser signifikanten Reorganisation eines komplexen Gewebes wie des Rückenmarks erfordert die Verwendung und Entwicklung präziser und kontrollierter experimenteller Ansätze.
Das primäre experimentelle Paradigma, das zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischen verwendet wird, besteht darin, chirurgische Mittel zu verwenden, um Gewebeschäden durch Resektion, Stechen oder Kryoverletzungen zu induzieren3,13. Diese Ansätze haben den Nachteil, dass sie eine spezifische Ausbildung in mikrochirurgischen Fähigkeiten erfordern, was für jeden neuen Bediener zeitaufwendig ist und ihre Verwendung in kurzfristigen Projekten verhindern kann. Darüber hinaus induzieren sie in der Regel Schäden am umgebenden Gewebe, die die Regeneration beeinflussen können.
Ein anderer Ansatz besteht darin, Zellschäden chemisch zu induzieren14 oder durch genetische Manipulationen15. Letzteres ermöglicht einen sehr gezielten Schaden. Eine solche Technik erfordert jedoch lange Vorarbeiten, um neue transgene Fische zu erzeugen, bevor ein Experiment durchgeführt wird, das jedes Mal erneuert wird, wenn ein einzigartiger Zelltyp ins Visier genommen wird.
Es besteht daher die Notwendigkeit einer Methode, die gezielte, aber vielseitige Läsionen ermöglicht, die für eine Vielzahl von Studien zur Regeneration geeignet sind. Eine Lösung besteht darin, einen Laser zu verwenden, um lokalisierte Schäden im interessierenden Gewebe zu induzieren16,17,18,19,20. Tatsächlich stellt die Verwendung von laserinduzierten Gewebeschäden einen robusten Ansatz zur Erzeugung von Rückenmarksläsionen mit vielen Vorteilen dar. Die mit solchen Lasermanipulationsmodulen ausgestatteten Mikroskope ermöglichen die Angabe eines kundenspezifisch geformten Bereichs, in dem die Zellablation stattfinden wird, mit dem zusätzlichen Vorteil der zeitlichen Kontrolle. Die Größe und Position der Läsion kann so angepasst werden, um eventuelle Fragen zu beantworten.
Das fehlende Merkmal der meisten Laserläsionssysteme ist die Möglichkeit, Verletzungen auf hochgradig reproduzierbare Weise für eine Reihe von Larven zu induzieren. Hier wird ein Originalprotokoll unter Verwendung eines UV-Lasers beschrieben, um halbautomatische, präzise und kontrollierte Läsionen in Zebrafischlarven zu induzieren, die auf einer mikrofluidischen Plattform basieren, die für die automatisierte Larvenhandhabung entwickelt wurde21. Darüber hinaus werden in dem hier vorgestellten System Larven in eine Glaskapillare eingeführt, die eine freie Rotation des Tieres um seine rostrocaudale Achse ermöglicht. Der Benutzer kann wählen, welche Seite der Larve dem Laser präsentiert werden soll, während die Fluoreszenzbildgebung den Laserstrahl präzise anvisieren und den Schaden nach der Läsion beurteilen kann.
Das hier beschriebene Protokoll wird mit einem halbautomatischen Zebrafischlarven-Bildgebungssystem in Kombination mit einer sich drehenden Scheibe verwendet, die mit einem UV-Laser ausgestattet ist (im Folgenden als VAST-System bezeichnet). Die Hauptpunkte des Protokolls und die meisten Ansprüche der Technik gelten jedoch für jedes System, das mit einem Laser ausgestattet ist, der zur Zellablation fähig ist, einschließlich Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopen, Spinnscheibenmikroskopen, die mit einem UV-Laser (FRAP-Modul) ausgestattet sind, oder Videomikroskope mit einem Lasermodul zur Fotomanipulation. Einer der Hauptunterschiede zwischen dem VAST-System und der konventionellen Probenhandhabung besteht darin, dass für letzteres die Montage von Larven in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt auf Glasabdeckungen / Petrischalen mit Glasboden erforderlich ist, anstatt sie in eine 96-Well-Platte zu laden.
Die Vorteile, die diese Methode bietet, eröffnen Möglichkeiten für innovative Forschungen zu den zellulären und molekularen Mechanismen während des Regenerationsprozesses. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Datenqualität quantitative Untersuchungen in einem multidisziplinären Kontext.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es besteht ein dringender Bedarf an einem tieferen Verständnis der Prozesse, die während der Regeneration in Zebrafischen ablaufen. Dieses Tiermodell bietet viele Vorteile für die biomedizinische Forschung, insbesondere für Rückenmarksverletzungen1. Die meisten Studien beinhalten manuelle Läsionen, die einen gut ausgebildeten Bediener erfordern und Multigewebeschäden verursachen. Hier wird ein Laserläsionsprotokoll vorgestellt, das die Kontrolle über die Läsionseigenschaften und die Verr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom BBSRC unterstützt (BB/S0001778/1). CR wird vom Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme finanziert. Wir danken David Greenald (CRH, University of Edinburgh) und Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) für das freundliche Geschenk transgener Fische (siehe Supplementary File). Wir danken Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) für den freundlichen Zugang zum 3i Spinning-Disk Konfokal.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
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