ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害
Summary
本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。
Abstract
ゼブラフィッシュの幼虫は、受精後わずか数日後に高い再生能力を有する完全に機能する中枢神経系(CNS)を有する。これにより、この動物モデルは脊髄損傷および再生の研究に非常に有用である。このような病変を誘導するための標準的なプロトコルは、体幹の背部を手動で通過させることである。しかしながら、この技術は広範な訓練を必要とし、追加の組織に損傷を与える。レーザー誘発病変がこれらの制限を回避するためのプロトコルが開発され、訓練を受けていないオペレータであっても、多くの動物上および異なるセッション間での脊髄切除の高い再現性と完全性を可能にした。さらに、組織損傷は、主に脊髄自体に限定され、異なる組織、例えば皮膚、筋肉、およびCNSを損傷することによる交絡効果を減少させる。さらに、脊髄の半血病変が可能である。レーザー損傷後の組織の完全性の保存を改善することで、電気生理学などの追加の分析に必要なさらなる解剖が容易になります。したがって、この方法は、手動では達成できない傷害程度の正確な制御を提供する。これにより、将来、この強力なモデルで新しい実験パラダイムが可能になります。
Introduction
哺乳類とは対照的に、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は怪我をした後、中枢神経系(CNS)を修復することができます1。脊髄再生のモデルとしてのゼブラフィッシュ幼虫の使用は比較的最近のことである。修復の根底にある細胞および分子のメカニズムを調査することは有益であることが証明されています2。これは、操作の容易さ、短い実験サイクル(毎週新しい幼虫)、組織の光透過性、および幼虫のサイズが小さく、 in vivo 蛍光顕微鏡に理想的であるためである。
脊髄再生の場合、幼虫を使用する2つの追加の利点は、回復の速度、成人の数週間と比較して数日、および手動技術を使用して傷害を誘発することの容易さである。これは、最近の調査を含む多くの研究3,4,5で首尾よく使用されています6,7。全体として、これは有意義なデータ生成の増加、実験プロトコルの高い適応性、および実験コストの削減につながります。受精後5日未満の幼虫の使用はまた、動物研究における3Rの原則に従う動物の使用を減少させる8。
ゼブラフィッシュの幼虫の脊髄損傷後、炎症反応、細胞増殖、神経新生、生存または新たに生成された細胞の移動、機能軸索の再構築、神経プロセス回路および脊椎組織のグローバルリモデリングなど、多くの生物学的プロセスが起こる6,7,9,10.うまくオーケストレーションされるために、これらのプロセスは、様々な細胞型、細胞外マトリックス成分、および生化学的シグナル11、12の間の細かく調節された相互作用を伴う。脊髄のような複雑な組織のこの重要な再編成の詳細を解明するには、正確で制御された実験的アプローチの使用と開発が必要です。
ゼブラフィッシュの脊髄再生を研究するために使用される主要な実験パラダイムは、切除、刺し傷、または凍結傷害によって組織損傷を誘発するために外科的手段を使用することです3,13。これらのアプローチには、マイクロサージャリースキルの特定のトレーニングを必要とするという欠点があり、これは新しいオペレータにとって時間がかかり、短期プロジェクトでの使用を妨げる可能性があります。さらに、それらは通常、周囲の組織に損傷を誘発し、再生に影響を与える可能性がある。
別のアプローチは、化学的に、または遺伝子操作によって細胞損傷を 誘発することです15。後者は、高度に標的を絞ったダメージを与えます。しかしながら、このような技術は、実験を行う前に新しいトランスジェニック魚を生成するために長い準備作業を必要とし、ユニークな細胞型が標的とされるたびに更新される。
したがって、再生における様々な研究に適した標的化が多目的な病変を可能にする方法の必要性がある。解決策は、レーザーを使用して、関心のある組織に局所的な損傷を誘発することである16、17、18、19、20。実際、レーザー誘発組織損傷の使用は、多くの利点を有する脊髄病変を生成するための堅牢なアプローチを提示する。このようなレーザー操作モジュールを搭載した顕微鏡は、細胞アブレーションが発生するカスタマイズされた形状領域を指定することができ、時間的制御のさらなる利点があります。したがって、病変の大きさおよび位置は、あらゆる質問に対処するために適合させることができる。
ほとんどのレーザー病変系に欠けている特徴は、一連の幼虫に対して再現性の高い方法で傷害を誘発する可能性である。ここでは、自動化された幼虫処理のために設計されたマイクロ流体プラットフォームに基づいて、ゼブラフィッシュ幼虫に半自動化された正確で制御された病変を誘導するために、UVレーザーを使用してオリジナルのプロトコルが説明されています21。さらに、ここで提示されたシステムでは、幼虫はガラス毛細血管に挿入され、これはその吻側尾軸の周りに動物の自由回転を可能にする。ユーザーは、幼虫のどちらの側をレーザーに提示するかを選択しながら、蛍光イメージングがレーザービームを正確に標的にし、病変後の損傷を評価することを可能にすることができる。
ここで説明するプロトコルは、半自動ゼブラフィッシュ幼虫イメージングシステムと、UVレーザーを搭載したスピニングディスク(以下、VASTシステムと呼ぶ)と組み合わせて使用されます。しかしながら、プロトコルの要点および技術の主張の大部分は、2光子レーザー走査顕微鏡、UVレーザーを備えたスピニングディスク顕微鏡(FRAPモジュール)、または光操作のためのレーザーモジュールを備えたビデオ顕微鏡を含む、細胞アブレーションが可能なレーザーを搭載したあらゆるシステムに対して有効である。VASTシステムと従来のサンプル処理の主な違いの1つは、後者の場合、96ウェルプレートに積み込む代わりに、ガラスカバースリップ/ガラス底ペトリ皿に低融点アガロースに幼虫を取り付ける必要があることです。
この方法によって提供される利点は、再生プロセス中の細胞および分子メカニズムに関する革新的な研究の機会を開く。さらに、高いデータ品質により、学際的な文脈での定量的調査が可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュの再生中に作用するプロセスのより深い理解が緊急に必要とされています。この動物モデルは、生物医学研究、特に脊髄損傷に多くの利点をもたらします1。ほとんどの研究は、十分に訓練されたオペレータを必要とし、多組織損傷を誘発する手動病変を含む。レーザー病変プロトコルがここに提示され、病変特性を制御し、周囲の組織への損傷を低減する…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究はBBSRC(BB/S0001778/1)の支援を受けた。CRは、プリンセスロイヤルテノバススコットランド医学研究奨学金プログラムによって資金提供されています。David Greenald(CRH、エジンバラ大学)とKaty Reid(CDBS、エジンバラ大学)に、トランスジェニック魚の親切な贈り物に感謝します( 補足ファイルを参照)。Daniel Soong(CRH、エジンバラ大学)が3iスピニングディスクコンフォカルに親切にアクセスしてくれたことに感謝します。
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- . National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: https://nc3rs.org.uk (2021)
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- . AndOr Micropoint Manual Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021)
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. . Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
